색소성 망막염을 모델링하기 위한 인간 환자 iPSC 유래 망막 오가노이드 생성

이 프로토콜에서는 색소성 망막염 환자 유도 만능줄기세포(iPSC) 유래 3D 망막 오가노이드를 생성했습니다. 이러한 오가노이드는 색소성 망막염 질환의 일부 임상 표현형을 성공적으로 요약했습니다.

색소성 망막염(RP)은 전 세계적으로 약 1/4,000명이 유병률을 이루는 희귀 유전성 망막 퇴행성 질환입니다. RP 환자의 대다수는 진행성 광수용체 변성을 가지고 있어 주변 시력 상실, 야맹증, 그리고 최종적으로 완전 실명으로 이어집니다. 현재까지 90개 이상의 유전자에서 수천 개의 돌연변이가 RP와 관련이 있는 것으로 보고되었습니다. 현재로서는 영향을 받은 모든 유전자와 다양한 유형의 돌연변이에 대해 사용할 수 있는 동물 모델이 거의 없기 때문에 유전자/돌연변이 병리학의 기저에 있는 메커니즘을 해독하는 데 큰 어려움을 겪고 치료 및 약물 개발을 제한합니다. 환자 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 3D 망막 오가노이드(RO)는 세포 및 동물보다 인간 조기 발병 질환을 모델링하는 데 더 나은 시스템을 제공했습니다. RP를 연구하기 위해 환자 유래 3D 망막 오가노이드를 활용하여 RP의 임상 표현형을 요약했습니다. RP 환자 유래 RO에서 Rhodopsin 국소화 불량이 명확하게 나타났습니다. 다른 동물 모델과 비교했을 때, 환자 iPSC 유래 망막 오가노이드 모델은 RP 특징을 더 밀접하게 재현했으며 질병 발병 기전 조사 및 약물 개발에 이상적인 접근 방식을 나타냅니다.

색소성 망막염(retinitis pigmentosa) 및 노화 관련 황반변성(age-related macular degeneration)과 같은 인간 망막 질환은 적절한 실험 모델이 없기 때문에 제대로 이해되지 못하고 있습니다 ^1,2. 쥐의 망막은 인간의 망막과 매우 유사하고 망막 변성의 병인을 연구하기 위한 강력한 도구이지만, 쥐와 인간 사이에는 엄청난 종 차이가 있습니다 ^3,4. 예를 들어, 생쥐와 인간의 광수용체 세포의 핵 구조는 다르며, 생쥐의 망막은 황반을 가지고 있지 않습니다 ^5,6. 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 기술을 통해 전사 인자 및/또는 화합물 ^7,8,9,10의 조합에 의한 "재프로그래밍" 과정을 통해 유기체의 특수 세포를 초기 만능 상태로 되돌릴 수 있습니다. 이러한 iPSC는 거의 무제한의 분열 및 증식 능력을 가지고 있으며 다양한 유형의 세포로 발전할 수 있습니다. 최근에는 인간 망막 발달의 초기 사건을 모델링하고 인간 망막 질환의 병태생리학을 설명하기 위해 iPSC 유래 3D 망막 오가노이드가 개발되었습니다 11,12,13,14,15. 망막 오가노이드는 많은 장점이 있습니다: (1) 생체 내 망막 발달 및 질병 발병을 재현하는 데 사용할 수 있습니다. (2) 고처리량 약물 스크리닝 및 유전자 치료의 전임상 시험에 사용할 수 있습니다. (3) 망막 퇴행성 질환에 대한 치료 옵션의 전임상 평가로 사용될 수 있다^16,17.

이 프로젝트의 한 가지 목적은 극도의 이질성으로 인해 치료가 불가능한 질병인 망막 색소증(RP)의 발병 기전을 연구하는 것이었습니다¹⁸. 현재까지 90개 이상의 유전자가 RP^19,20과 관련이 있는 것으로 확인되었습니다. RP¹⁵의 가장 흔한 원인 유전자 중 하나로 간주되는 RPGR 유전자는 모든 RP ^4,21,22의 약 16%를 차지합니다. RPGR 유전자에서 프레임시프트 돌연변이를 지닌 iPSC는 성공적으로 생성되어 조직화되고 계층화된 3D 망막 오가노이드로 분화되었습니다¹⁴. 이러한 오가노이드를 활용하여 비정상적인 광수용체 층 형태와 광수용체에서 옵신의 전위가 관찰되었습니다.

전체적으로 환자 유래 3D 망막 오가노이드를 생성하는 방법에 대해 단계적이고 접근 가능한 프로토콜이 여기에 자세히 설명되어 있습니다^23,24. 이러한 오가노이드는 질병의 일부 임상 표현형을 성공적으로 요약했습니다. 이는 망막 발달 및 질병 메커니즘을 연구하고, 치료 스크리닝을 수행하고, 향후 전임상 유전자 치료를 평가할 수 있는 고무적인 모델을 제공합니다.

이 프로토콜은 Capital Medical University의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 세포 배양 및 iPSC의 생성

1. 이 연구에서는 RPGR 환자를 선택합니다. 여기에서는 3명의 환자, 1명의 가족성 보인자와 3명의 건강한 대조군이 사용되었습니다. 환자 1은 RPGR 유전자의 엑손 14에 c.1685_1686delAT 돌연변이를 가지고 있었고, 환자 2는 RPGR 유전자의 엑손 15에 c.2234_2235delGA 돌연변이를, 환자 3은 RPGR 유전자의 엑손 15에 c.2403_2404delAG 돌연변이를 가지고 있었습니다. 건강한 지원자 3명을 대조군으로 선택¹⁴. 환자로부터 말초 전혈 샘플을 수집하고 정맥 천자로 건강한 대조군을 대조하여 채혈 튜브에 넣습니다(재료 표).
2. 밀도 구배 매체를 사용한 밀도 구배 원심분리로 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리합니다²⁵. 페트리 접시에서 8mL의 성장 증진 배지(표 1)에서 사이토카인으로 활성화된 CD34⁺ PBMC를 확장하십시오.
3. 1주일 후, transfection system(Table of Materials)으로 CD34 양성 말초 혈액 단핵 세포를 전기천공하고 CD34 양성 세포와 내장된 T-01 프로그램을 수정 없이 선택합니다. 인간 OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, c-MYC 및 KLF4 단백질을 생산할 수 있는 재프로그래밍 플라스미드(2μg) 칵테일을 트랜스펙션합니다.
4. B-27 (1x), N-2 (1x), PD0325901 (0.5 μM), bFGF (100 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), HA-100 (10 μM), A-83-01 (0.5 μM) 및 hLIF(1000 U/mL)가 보충된 2 mL의 DMEM/ F12에 vitronectin 인간 재조합 단백질 코팅된 6-well 플레이트에 형질주입된 세포를 파종하여 iPSC의 성장을 유지합니다.
5. 형질도입 3주 후, iPSC의 콜로니를 수동으로 채취한 후 6웰 플레이트로 옮기고 증식을 위해 시약 B(Table of Materials)에 유지합니다.
   참고: 6웰 플레이트는 비트로넥틴 인간 재조합 단백질로 코팅되어야 합니다. 최종 농도 10μg/mL에 도달하기 위해 DPBS에서 비트로넥틴 용액을 희석합니다. 희석된 비트로넥틴을 조직 배양 처리된 6웰 플레이트에 첨가합니다. 배양기를 소용돌이쳐 비트로넥틴 용액을 6웰 플레이트의 표면에 고르게 펴 바릅니다. 플레이트를 37 ° C에서 최소 1 시간 동안 배양합니다.
6. iPSC가 약 80%-90% 합류점에 도달할 때 세포가 0.5mM EDTA로 분리되고 분할 비율이 1:8 또는 1:10인지 확인합니다. 통과 당일에 시약 B에 블레비스타틴(2.5μM)을 첨가합니다(표 1).
   참고: 블레비스타틴은 세포 부착 및 줄기세포 생존력을 촉진하고 줄기세포 사멸을 예방하는 데 사용되었습니다. 18시간 후, 배지는 시약 B로 새로 고쳐야 합니다.

2. 인간 RO 생성

참고: iPSC가 약 80%-90% 합류점에 도달하면 iPSC를 해리해야 합니다.

1. 0.5 mM EDTA를 사용하여 37 ◦C에서 5분 동안 인간 iPSC(hiPSC) 집락을 해리합니다.
2. 부드러운 피펫팅을 통해 hiPSC 덩어리를 단일 세포로 분리합니다. 유지 관리를 위해 세포를 세고 시약 B에서 성장시킵니다(표 1).
3. 0일차에 100μL의 분화 배지에서 세포 재응집을 위해 96개의 V-바닥 원뿔형 웰에 12,000개의 세포/웰을 시딩합니다(표 1).
4. 6일차에 세포 배양 배지를 조심스럽게 흡인하고 20μM Y 27632 및 1.5nM(55ng/mL) hBMP4를 함유하는 분화 배지 100μL를 추가합니다.
5. 9일차에 분화 배지의 절반을 교체하여 hBMP4 농도를 약 0.75nM으로 유지합니다.
6. 각 웰에서 60 μL의 분화 배지를 흡인하고 각 웰에 20 μM Y-27632를 함유한 새로운 분화 배지 60 μL를 추가합니다.
7. 12일차에 분화 배지의 절반을 새로운 분화 배지로 교체하여 0.375nM hBMP4를 달성합니다.
8. 18일째에 응집체를 10mL 팁이 있는 새 페트리 접시에 옮기고 도립 현미경으로 미세 수술 칼로 각 응집체를 2-4조각으로 잘라 더 많은 오가노이드를 생성합니다.
9. 동일한 그룹의 응집체를 하나의 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 응집체가 튜브 바닥으로 가라앉으면 상층액을 흡인합니다.
10. 1mL의 신경 망막 배지(DMEM/F12, 10% 소 태아 혈청, 1% N-2 보충제, 0.5μM 레티노산, 0.1mM 타우린, 1% 페니실린-스트렙토마이신)로 응집체를 재현탁하고 15mL의 신경 망막 배지가 들어 있는 붙지 않는 페트리 접시에 옮깁니다. 페트리 접시 하나에 10-15개의 망막 오가노이드를 넣습니다.
11. 5일마다 배양 배지를 새로 고칩니다. 레티노산은 빛에 민감하기 때문에 배양을 어두운 곳에 보관하고(그림 1) 도립 현미경 ^26,27,28,29으로 자가 조직화 인간 망막 조직의 형성을 확인합니다.

3. 망막 오가노이드 분석

1. hiPSC 유래 3D 망막의 면역형광 염색
   1. DPBS에 새로운 4% 파라포름알데히드 1mL에 3D 망막을 4°C에서 20분 동안 고정합니다. 그런 다음 1mL의 DPBS 버퍼로 오가노이드를 헹굽니다.
   2. 아가로스 0.5g(재료 표)을 측정하고 전자레인지용 플라스크에 아가로스 분말과 DPBS 100mL를 혼합합니다. 전자레인지를 사용하여 아가로스가 완전히 녹을 때까지 1-3분 동안 녹입니다. 아가로스 용액을 약 40°C로 식힙니다.
   3. DPBS에서 2%에 포함합니다.
   4. 비브라톰을 사용하여 샘플을 50μm 두께의 섹션으로 자릅니다. 절단된 부분을 접착 현미경 슬라이드(재료 표)에 놓고 -80°C에서 보관합니다.
   5. 실온(RT)에서 15분 동안 슬라이스를 해동합니다.
   6. DPBS로 슬라이스를 5분 동안 씻고 3회 반복합니다.
   7. DPBS 용액에 0.5% Triton X-100을 사용하여 RT에서 15분 동안 슬라이스를 투과화합니다.
   8. 투과화 용액을 제거하고 DPBS로 슬라이스를 5분 동안 씻은 다음 3회 반복합니다.
   9. DPBS에서 1% BSA와 0.5% Triton X-100으로 슬라이스를 RT에서 30분 동안 배양합니다.
   10. 1% BSA 및 0.1% Triton X-100에 희석된 항-로돕신 항체(1:1000) 및 항-L/M 옵신 항체(1:1000)로 슬라이스를 4°C에서 16시간 동안 배양합니다.
   11. DPBS로 슬라이스를 5분 동안 씻고 3회 반복합니다.
   12. RT에서 1시간 동안 1% BSA와 0.1% Triton X-100에 희석한 당나귀 항 마우스 및 토끼 2차 항체(1:500)로 슬라이스를 배양합니다.
   13. 핵 염색을 위해 RT에서 15분 동안 DPBS에 30nM 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)을 추가합니다.
   14. DPBS로 슬라이스를 5분 동안 씻고 5회씩 반복합니다.
   15. 임베딩 매체(Table of Materials)로 슬라이스를 장착하고 슬라이드(Table of Materials)를 덮습니다. 어두운 상자에 보관하고 4 °C에서 최대 4 주 동안 보관하십시오.
2. RNA 추출 및 RNA 염기서열분석
   1. 동일한 분화 시점(0일, 47일, 91일, 121일, 151일)에서 각 대조군과 환자로부터 파생된 1-3개의 3D 망막을 얼음 위의 RNA 추출 시약(Table of Materials)에 수집합니다.
   2. 균질화기(재료 표)를 사용하여 샘플을 1분 ON, 30초 OFF로 3회 주기 동안 중단하고 샘플의 중단을 확인합니다.
   3. 샘플이 완전히 균질화되면 균질화를 중지하고 튜브를 30초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다.
   4. 얼음 위에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.
   5. 4°C에서 15분 동안 13,800 x g 의 시료를 원심분리하고 상등액을 새로운 2mL RNase-free 튜브로 옮깁니다.
   6. 클로로포름 0.4mL를 튜브, 와류 및 원심분리기에 13,800 x g 으로 4°C에서 10분 동안 추가합니다.
   7. 무색 상부상의 일부(약 2/3)를 새로운 RNase-free 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. DNA가 포함된 흰색 계면을 흡인하거나 방해하지 마십시오.
   8. 0.5mL의 저온 이소프로판올을 추가하고 30초 동안 와류를 넣고 4°C에서 15분 동안 13,800 x g 으로 원심분리합니다. 튜브 바닥 측면에 펠릿이 형성됩니다.
   9. 피펫 팁으로 상층액을 조심스럽게 흡입하고 펠릿을 보관하십시오.
      참고: RNA 펠릿은 순도가 매우 높을 때 젤리와 같고 투명합니다.
   10. 차가운 70% 에탄올 1mL를 넣고 30초 동안 샘플을 격렬하게 소용돌이치게 한 다음 4°C에서 10분 동안 13,800 x g 으로 원심분리합니다.
   11. 피펫 팁으로 상등액을 조심스럽게 흡입하고 펠릿을 실온 온도에서 후드에서 5-10분 동안 자연 건조합니다. 펠릿을 과도하게 건조하지 마십시오.
   12. 20-50 μL의 RNase-free 물을 추가하고 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.
   13. 분광 광도계에 1μL의 RNA를 적용합니다(재료 표). 대조군과 환자로부터 각각 약 10μg의 RNA를 Illumina 라이브러리 제^{제 30}에 사용했습니다.
   14. RNA를 -80°C에서 보관하십시오.

이 개략적인 그림은 건강한 환자 iPSC 유래 망막 오가노이드를 생성하기 위한 분화 절차를 설명합니다(그림 1). iPSC에서 RO에 이르기까지, 여러 요인으로 인해 변형이 발생할 수 있습니다. iPSC의 상태는 RO 생성의 결정 단계입니다. 또한 연구자는 전체 실험을 추적할 수 있도록 모든 매체의 모든 단계, 카탈로그 및 로트 번호를 기록하는 것이 좋습니다. <...

망막 오가노이드는 hiPSC 또는 배아 줄기 세포(ESC)에서 파생된 3D 적층 구조이며 인간 망막 발달의 공간적 및 시간적 패턴을 모방할 수 있는 매우 유망한 모델로 특징지어집니다^31,32. RO는 광수용체(photoreceptor), 양극성 세포(bipolar cell), 신경절 세포(ganglion cell), 무축삭 세포(amacrine cell), 수평 세포(horizontal cell) 및 뮐러(Müller) 신경교?...

모든 저자는 이해 상충을 공개하지 않습니다.

원고에 대한 기술 지원과 유용한 의견을 제공해 주신 M.S. Yan-ping Li와 Zhuo-lin Liu에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 국가자연과학재단(82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), 베이징시 자연과학재단(Z200014, 82125007), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2017YFA0105300)의 일부 지원을 받았다.