Создание органоидов сетчатки, полученных из ИПСК у пациента, для моделирования пигментного ретинита

В этом протоколе у пациентов с пигментным ретинитом были созданы 3D-органоиды сетчатки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток (iPSC). Эти органоиды успешно повторили некоторые клинические фенотипы пигментного ретинита.

Пигментный ретинит (РП) является редким наследственным дегенеративным заболеванием сетчатки с распространенностью около 1/4000 человек во всем мире. У большинства пациентов с РП наблюдается прогрессирующая дегенерация фоторецепторов, приводящая к потере периферического зрения, ночной слепоте и, наконец, полной слепоте. На сегодняшний день сообщалось о тысячах мутаций в более чем 90 генах, связанных с РП. В настоящее время существует несколько животных моделей для всех пораженных генов и различных типов мутаций, что в значительной степени затрудняет расшифровку механизмов, лежащих в основе патологии генов/мутаций, и ограничивает лечение и разработку лекарств. Индуцированные пациентами 3D-органоиды сетчатки (РО), полученные из плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), обеспечили лучшую систему для моделирования раннего начала заболевания человека, чем клетки и животные. Для изучения РП эти полученные от пациента 3D-органоиды сетчатки были использованы для повторения клинических фенотипов РП. В РО РП, полученных от пациентов, отчетливо проявлялась неправильная локализация родопсина. По сравнению с другими животными моделями, модели органоидов сетчатки пациента, полученные из iPSC, более точно повторяют особенности RP и представляют собой идеальный подход к исследованию патогенеза заболевания и разработке лекарств.

Заболевания сетчатки человека, такие как пигментный ретинит и возрастная макулярная дегенерация, плохо изучены из-за отсутствия соответствующих экспериментальных моделей ^1,2. Хотя сетчатка мыши очень похожа на сетчатку человека и является мощным инструментом для изучения этиологии дегенерации сетчатки, существуют огромные видовые различия между мышами^{и людьми.} Например, ядерная архитектура фоторецепторных клеток у мышей и человека отличается, а сетчатка мышей не обладает макулой ^5,6. Технология индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) позволяет нам возвращать специализированные клетки организмов в исходное плюрипотентное состояние посредством процессов «перепрограммирования» комбинацией транскрипционных факторов и/или соединений 7,8,9,10. Эти иПСК обладают почти неограниченной способностью к делению и пролиферации и могут развиваться в различные типы клеток. В последнее время были разработаны трехмерные органоиды сетчатки, полученные из ИПСК для моделирования ранних событий развития сетчатки человека и определения патофизиологии заболеваний сетчатки человека 11,12,13,14,15. Органоиды сетчатки имеют много преимуществ: (1) они могут быть использованы для повторения in vivo развития сетчатки и патогенеза заболевания; (2) они могут быть использованы для высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов и доклинических испытаний генной терапии; и (3) они могут быть использованы в качестве доклинической оценки вариантов лечения дегенеративных заболеваний сетчатки^16,17.

Одной из целей этого проекта было изучение патогенеза пигментозы сетчатки (РП), заболевания, остающегося неизлечимым из-за своей крайней гетерогенности^. На сегодняшний день было идентифицировано более 90 генов, связанных с RP^19,20. Ген RPGR, который считается одним из наиболее распространенных генов-возбудителей RP¹⁵, составляет примерно 16% всех RP ^4,21,22. iPSCs, несущие мутацию сдвига рамки считывания в гене RPGR, были успешно сгенерированы и дифференцированы в организованные и стратифицированные 3D органоиды сетчатки¹⁴. При использовании этих органоидов наблюдалась аномальная морфология слоя фоторецепторов и дислокация опсинов в фоторецепторах.

В целом, здесь подробно описан пошаговый и доступный протокол о том, как получить полученные от пациента 3D-органоиды сетчатки^23,24. Эти органоиды успешно повторили некоторые клинические фенотипы заболевания. Это обеспечивает обнадеживающую модель для изучения развития сетчатки и механизмов заболевания, для терапевтического скрининга и оценки будущей доклинической генной терапии.

Протокол соответствует рекомендациям комитета по этике исследований человека Столичного медицинского университета.

1. Культивирование клеток и генерация ИПСК

1. Выберите пациентов RPGR для участия в этом исследовании. Здесь были использованы три пациента, один семейный носитель и три здоровых человека из контрольной группы. Пациент 1 обладал мутацией c.1685_1686delAT в экзоне 14 гена RPGR, пациент 2 имел мутацию c.2234_2235delGA в экзоне 15 гена RPGR, а пациент 3 имел c.2403_2404delAG мутации в экзоне 15 гена RPGR. Выберите трех здоровых добровольцев в качестве контрольной^{группы 14}. Соберите образцы периферической цельной крови у пациентов и здоровых контрольных групп с помощью венепункции и поместите их в пробирки для сбора крови (Таблица материалов).
2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) методом центрифугирования с градиентом плотности в среде с градиентом плотности²⁵. Расширяйте CD34⁺ PBMCs, активированные цитокином, в 8 мл среды для усиления роста (табл. 1) в чашке Петри.
3. Через 1 неделю электропорируют CD34-положительные мононуклеарные клетки периферической крови с помощью трансфекционной системы (Таблица материалов) и выбирают CD34-положительные клетки и встроенную программу T-01 без каких-либо модификаций. Трансфектировать коктейль перепрограммируемых плазмид (2 мкг), которые могут производить человеческие белки OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, c-MYC и KLF4.
4. Засейте трансфицированные клетки в человеческие шестилуночные планшеты, покрытые рекомбинантным белком, в 2 мл DMEM/F12 с добавлением B-27 (1x), N-2 (1x), PD0325901 (0,5 μM), bFGF (100 нг/мл), CHIR99021 (3 μM), HA-100 (10 μM), A-83-01 (0,5 μM) и hLIF (1000 Ед/мл) для поддержания роста iPSCs.
5. Через 3 недели после трансдукции вручную отоберите колонии ИПСК вручную, затем перенесите их в шестилуночные планшеты и поддерживайте в реагенте В (Table of Materials) для расширения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шестилуночные планшеты должны быть покрыты человеческим рекомбинантным белком витронектином. Раствор витронектина развести в DPBS до конечной концентрации 10 мкг/мл. Добавьте разведенный витронектин в шестилуночные планшеты, обработанные тканевой культурой. Перемешайте посуду, чтобы раствор витронектина равномерно распределился по поверхности шестилуночных планшетов. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C не менее 1 часа.
6. Убедитесь, что клетки дезагрегированы с помощью 0,5 мМ ЭДТА, когда iPSCs достигают примерно 80%-90% слияния, и что коэффициент расщепления составляет 1:8 или 1:10. В день пассажа добавьте к реагенту В блеббистатин (2,5 мкМ) (табл. 1).
   Примечание: Блеббистатин использовался для стимулирования адгезии клеток и жизнеспособности стволовых клеток, а также для предотвращения апоптоза стволовых клеток. Через 18 ч среду следует освежить реагентом В.

2. Генерация человеческих RO

ПРИМЕЧАНИЕ: ИПСК должны быть диссоциированы, когда ИПСК достигают примерно 80%-90% слияния.

1. Диссоциацию колоний iPSC человека (hiPSC) с помощью 0,5 мМ ЭДТА при 37 °C в течение 5 мин.
2. Разделите скопления ИПСК на отдельные клетки с помощью щадящего пипетирования. Подсчитайте клетки для поддержания и вырастите их в реагенте В (Таблица 1).
3. В день 0 засейте 12 000 клеток/лунку в 96 V-образных конических лунок для реагрегации клеток в 100 мкл дифференцировочной среды (табл. 1).
4. На 6-й день тщательно отсасывают среду для культивирования клеток и добавляют 100 мкл среды для дифференцировки, содержащей 20 мкМ Y 27632 и 1,5 нМ (55 нг/мл) hBMP4.
5. На 9-й день замените половину дифференцировочной среды, чтобы поддерживать концентрацию hBMP4 на уровне около 0,75 нМ.
6. Отбирайте 60 мкл дифференцировочной среды из каждой лунки и добавляйте 60 мкл свежей дифференцировочной среды, содержащей 20 мкМ Y-27632, в каждую лунку.
7. На 12-й день замените половину среды для дифференцировки свежей средой для дифференцировки до 0,375 нМ hBMP4.
8. На 18-й день перенесите агрегаты в новую чашку Петри с наконечниками объемом 10 мл и разрежьте каждый агрегат на 2-4 части микрохирургическим ножом под перевернутым микроскопом, чтобы получить больше органоидов.
9. Переложите агрегаты из одной группы в одну центрифужную пробирку объемом 15 мл. Когда агрегаты осядут на дно трубок, отсасывайте надосадочную жидкость.
10. Ресуспендируют агрегаты с 1 мл нервной сетчатки (DMEM/F12, 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% добавку N-2, 0,5 мкМ ретиноевой кислоты, 0,1 мМ таурина, 1% пенициллин-стрептомицина) и переносят их в антипригарные чашки Петри с 15 мл нейронной среды сетчатки. Положите 10-15 органоидов сетчатки в одну чашку Петри.
11. Обновляйте питательную среду каждые 5 дней. Храните культуру в темноте, так как ретиноевая кислота чувствительна к свету (рис. 1) и проверьте формирование самоорганизующейся ткани сетчатки человека с помощью инвертированного микроскопа 26,27,28,29.

3. Анализ органоидов сетчатки

1. Иммунофлуоресцентное окрашивание 3D-сетчатки, полученной из hiPSC
   1. Зафиксировать 3D сетчатку в 1 мл свежего 4% параформальдегида в DPBS на 20 мин при 4 °C. Затем промойте органоиды 1 мл буфера DPBS.
   2. Отмерьте 0,5 г агарозы (Таблица материалов) и смешайте порошок агарозы со 100 мл DPBS в колбе для микроволновой печи. С помощью микроволновой печи растворите агарозу в течение 1-3 минут до полного ее растворения. Дайте агарозному раствору остыть примерно до 40 °C.
   3. Встраиваем их в 2% в DPBS.
   4. Нарежьте образцы на участки толщиной 50 мкм с помощью вибратома. Поместите срезанные срезы на предметные стекла адгезионного микроскопа (Таблица материалов) и храните их при температуре −80 °C.
   5. Разморозьте ломтики в течение 15 минут при комнатной температуре (RT).
   6. Промойте ломтики с помощью DPBS в течение 5 минут и повторите 3 раза.
   7. Используйте 0,5% Triton X-100 в растворе DPBS для пропитывания ломтиков в течение 15 минут при RT.
   8. Удалите раствор для пермеабилизации, промойте ломтики с помощью DPBS в течение 5 минут и повторите 3 раза.
   9. Инкубируйте ломтики с 1% BSA и 0,5% Triton X-100 в DPBS в течение 30 минут при RT.
   10. Инкубируют срезы с антителом против родопсина (1:1000) и антителом против L/M опсина (1:1000), разведенными в 1% BSA и 0,1% Triton X-100 в течение 16 часов при 4 °C.
   11. Промойте ломтики с помощью DPBS в течение 5 минут и повторите 3 раза.
   12. Инкубируйте срезы с ослиным антителом против мышей и кролика (1:500), разведенным в 1% BSA и 0,1% Triton X-100, в течение 1 ч в режиме RT.
   13. Добавьте 30 нМ 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в DPBS на 15 мин в RT для ядерного окрашивания.
   14. Промойте ломтики с помощью DPBS в течение 5 минут и повторите 5 раз.
   15. Смонтируйте срезы с помощью закладного материала (Table of Materials) и закройте слайды (Table of Materials). Хранить в темной коробке при температуре 4 °C до 4 недель.
2. Экстракция РНК и секвенирование РНК
   1. Соберите 1-3 (в зависимости от размеров) 3D сетчатки, полученную от каждого контрольного человека и пациента в одни и те же моменты времени дифференцировки (день 0, день 47, день 91, день 121 и день 151) в 1 мл реагента для экстракции РНК (Таблица материалов) на льду.
   2. Используйте гомогенизатор (Таблица материалов) для разрушения образцов, 1 мин ВКЛ, 30 с ВЫКЛ в течение трех циклов, и проверьте образец на разрушение.
   3. Остановите гомогенизацию, когда образцы будут полностью гомогенизированы, и энергично поворачивайте пробирку в течение 30 с.
   4. Инкубируйте образцы на льду в течение 15 минут.
   5. Центрифугируйте образцы при давлении 13 800 x g в течение 15 мин при 4 °C и перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 2 мл без РНКазы.
   6. Добавьте 0,4 мл хлороформа в пробирку, вихревую и центрифугу при 13 800 x g в течение 10 минут при 4 °C.
   7. Осторожно перенесите часть (около 2/3) бесцветной верхней фазы в новую пробирку, не содержащую РНКазы. Не аспирируйте и не тревожьте белую границу, содержащую ДНК.
   8. Добавьте 0,5 мл холодного изопропанола, вортекс в течение 30 с и центрифугируйте при 13 800 x g в течение 15 минут при 4 °C. Сбоку от дна трубки образуется гранула.
   9. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью наконечника пипетки и удерживайте гранулу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула РНК имеет желеобразную форму и прозрачна при очень высокой чистоте.
   10. Добавьте 1 мл холодного 70% этанола, энергично перебейте образцы в течение 30 с и центрифугируйте при 13 800 x g в течение 10 минут при 4 °C.
   11. Осторожно отсадите надосадочную жидкость с помощью наконечника пипетки и высушите гранулу на воздухе в вытяжке при температуре RT в течение 5-10 минут. Не стоит пересушивать гранулы.
   12. Добавьте 20-50 μл воды, не содержащей РНКазы, и осторожно повторно суспендируйте гранулу, пипетируя вверх и вниз.
   13. Нанесите 1 мкл РНК на спектрофотометр (Таблица материалов). В общей сложности около 10 мкг РНК от контрольной группы и пациентов соответственно использовали для подготовки библиотеки Illumina³⁰.
   14. Храните РНК при температуре −80 °C.

На схематической иллюстрации описаны процедуры дифференцировки для получения здоровых и больных органоидов сетчатки, полученных из ИПСК (Рисунок 1). От iPSC до RO вариации могут быть получены в зависимости от нескольких факторов. Статус iPSC является опред...

Органоиды сетчатки представляют собой трехмерные слоистые структуры, полученные из ИПСК или эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), и представляют собой очень многообещающую модель для имитации пространственных и временных закономерностей развития сетчатки человек?...

Все авторы не раскрывают конфликт интересов.

Мы благодарим М.С. Янь-пина Ли и Чжо-линь Лю за их техническую поддержку и полезные комментарии относительно рукописи. Эта работа была частично поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), Пекинским муниципальным фондом естественных наук (Z200014, 82125007) и Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2017YFA0105300).