JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذا البروتوكول ، تم إنشاء خلايا جذعية ثلاثية الأبعاد مشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) من التهاب الشبكية الصباغي. نجحت هذه العضيات في تلخيص بعض الأنماط الظاهرية السريرية لمرض التهاب الشبكية الصباغي.

Abstract

التهاب الشبكية الصباغي (RP) هو مرض تنكسي نادر ووراثي في الشبكية ينتشر فيه ما يقرب من 1/4,000 شخص في جميع أنحاء العالم. يعاني غالبية مرضى RP من تنكس مستقبلات ضوئية تدريجي يؤدي إلى فقدان البصر المحيطي ، والعمى الليلي ، وأخيرا العمى التام. حتى الآن ، تم الإبلاغ عن وجود آلاف الطفرات في أكثر من 90 جينا مرتبطة ب RP. حاليا ، هناك عدد قليل من النماذج الحيوانية المتاحة لجميع الجينات المصابة وأنواع مختلفة من الطفرات ، مما يعيق إلى حد كبير فك رموز الآليات الكامنة وراء أمراض الجينات / الطفرات ويحد من العلاج وتطوير الأدوية. وفرت الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستمدة من المريض (iPSC) العصيات ثلاثية الأبعاد (ROs) نظاما أفضل لنمذجة مرض الإنسان المبكر من الخلايا. من أجل دراسة RP ، تم استخدام تلك العضيات ثلاثية الأبعاد المشتقة من المريض لتلخيص الأنماط الظاهرية السريرية ل RP. في ROs المشتقة من المريض RP ، تم عرض تحديد موقع رودوبسين بشكل واضح. بالمقارنة مع النماذج الحيوانية الأخرى, النماذج العضوية الشبكية المشتقة من iPSC للمريض تلخص عن كثب ميزات RP وتمثل نهجا مثاليا للتحقيق في التسبب في المرض وتطوير الأدوية.

Introduction

أمراض الشبكية البشرية ، مثل التهاب الشبكية الصباغي والتنكس البقعي المرتبط بالعمر ، غير مفهومة جيدا بسبب عدم وجود نماذج تجريبية مناسبة1،2. على الرغم من أن شبكية العين الفأرية تشبه إلى حد بعيد شبكية العين البشرية وهي أداة قوية لدراسة مسببات تنكس الشبكية ، إلا أن هناك اختلافات كبيرة في الأنواع بين الفئران والبشر3،4. على سبيل المثال ، تختلف البنية النووية للخلايا المستقبلة للضوء في الفئران والبشر ، ولا تمتلك شبكية الفأر البقعة5،6. تمكننا تقنية الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) من إعادة الخلايا المتخصصة للكائنات الحية إلى الحالة الأولية متعددة القدرات من خلال عمليات "إعادة البرمجة" عن طريق مجموعات من عوامل النسخ و / أو المركبات7،8،9،10. هذه iPSCs لديها قدرة غير محدودة تقريبا على الانقسام والانتشار ويمكن أن تتطور إلى أنواع مختلفة من الخلايا. في الآونة الأخيرة, وقد تم تطوير عضيات الشبكية 3D المشتقة من iPSC لنمذجة الأحداث المبكرة لتطور الشبكية البشرية ولتحديد الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الشبكية البشرية 11,12,13,14,15. تتمتع عضيات الشبكية بالعديد من المزايا: (1) يمكن استخدامها لتلخيص تطور الشبكية في الجسم الحي والتسبب في المرض. (2) يمكن استخدامها لفحص الأدوية عالي الإنتاجية والتجارب قبل السريرية للعلاج الجيني ؛ و (3) يمكن استخدامها كتقييمات قبل سريرية لخيارات العلاج للأمراض التنكسية في الشبكية16،17.

كان أحد أهداف هذا المشروع هو دراسة التسبب في صبغة الشبكية (RP) ، وهو مرض لا يزال غير قابل للشفاء بسبب عدم تجانسها الشديد18. حتى الآن ، تم تحديد أكثر من 90 جينا مرتبطا ب RP19،20. يمثل جين RPGR ، الذي يعتبر أحد أكثر الجينات المسببة انتشارا ل RP15 ، ما يقرب من 16٪ من جميع RP4،21،22. iPSCs التي تحمل طفرة إطراع في جين RPGR وقد تم إنشاؤها بنجاح وتمايزها إلى عضويات شبكية ثلاثية الأبعاد منظمة وطبقية14. من خلال استخدام هذه العضيات ، لوحظ مورفولوجيا طبقة مستقبلات الضوء غير الطبيعية وخلع الأوبسين في المستقبلات الضوئية.

إجمالا ، يتم وصف بروتوكول خطوة بخطوة وودود بالتفصيل هنا حول كيفية توليد عضيات شبكية ثلاثية الأبعاد مشتقة من المريض23،24. نجحت هذه العضيات في تلخيص بعض الأنماط الظاهرية السريرية للمرض. يوفر هذا نموذجا مشجعا لدراسة تطور الشبكية وآليات المرض ، للفحص العلاجي ، وتقييم العلاج الجيني قبل السريري في المستقبل.

Protocol

يتبع البروتوكول إرشادات لجنة أخلاقيات البحث البشري بجامعة العاصمة الطبية.

1. ثقافة الخلايا وتوليد iPSCs

  1. اختر مرضى RPGR لهذه الدراسة. هنا ، تم استخدام ثلاثة مرضى ، حامل عائلي واحد وثلاثة عناصر تحكم صحية. يمتلك المريض 1 طفرة c.1685_1686delAT في exon 14 من جين RPGR ، وكان المريض 2 يؤوي طفرة c.2234_2235delGA في exon 15 من جين RPGR ، والمريض 3 لديه طفرة c.2403_2404delAG في exon 15 من جين RPGR. اختر ثلاثة متطوعين أصحاء كعناصر تحكم14. جمع عينات الدم الكامل المحيطية من المرضى والضوابط الصحية مع بزل الوريد ، ووضعها في أنابيب جمع الدم (جدول المواد).
  2. عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) عن طريق الطرد المركزي المتدرج للكثافة بوسط تدرج الكثافة25. قم بتوسيع CD34 + PBMCs المنشطة بالسيتوكين في 8 مل من وسط تعزيز النمو (الجدول 1) في طبق بتري.
  3. بعد أسبوع واحد ، قم بالكهرباء بخلايا الدم المحيطية أحادية النواة الإيجابية CD34 بنظام تعداء (جدول المواد) واختر الخلايا الإيجابية CD34 وبرنامج T-01 المدمج دون أي تعديل. قم بنقل مزيج من البلازميدات المعاد برمجتها (2 ميكروغرام) التي يمكن أن تنتج بروتينات OCT4 و SOX2 و NANOG و LIN28 و c-MYC و KLF4 البشرية.
  4. بذرة الخلايا المنقولة في فيترونكتين البشري المؤتلف المغلفة بالبروتين ستة آبار لوحات في 2 مل من DMEM / F12 مكملة ب B-27 (1x), N-2 (1x), PD0325901 (0.5 ميكرومتر), bFGF (100 نانوغرام/مل), CHIR99021 (3 ميكرومتر), HA-100 (10 ميكرومتر) , A-83-01 (0.5 ميكرومتر), و hLIF (1000 U/مل) للحفاظ على نمو iPSCs.
  5. 3 أسابيع بعد التنبيغ, اختيار مستعمرات iPSCs يدويا, بعد ذلك نقلها إلى لوحات ستة آبار, والحفاظ عليها في الكاشف B (جدول المواد) للتوسع.
    ملاحظة: يجب طلاء الألواح المكونة من ستة آبار ببروتين مؤتلف فيترونكتين البشري. يخفف محلول الفيترونكتين في DPBS للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام / مل. أضف الفيترونكتين المخفف إلى ألواح ستة آبار معالجة بزراعة الأنسجة. قم بتدوير الأواني المزروعة لتوزيع محلول الفيترونكتين بالتساوي على سطح الألواح المكونة من ستة آبار. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
  6. تأكد من أن الخلايا مصنفة مع 0.5 ملي EDTA عندما تصل iPSCs إلى حوالي 80٪-90٪ التقاء وأن نسبة الانقسام هي 1:8 أو 1:10. في يوم المرور ، أضف البيبستاتين (2.5 ميكرومتر) إلى الكاشف B (الجدول 1).
    ملاحظة: تم استخدام Blebbistatin لتعزيز التصاق الخلايا وقابلية الخلايا الجذعية للحياة ومنع موت الخلايا المبرمج للخلايا الجذعية. بعد 18 ساعة ، يجب تحديث الوسط بالكاشف ب.

2. توليد ROs البشرية

ملاحظة: يجب فصل iPSCs عندما تصل iPSCs إلى حوالي 80٪-90٪ التقاء.

  1. تفكيك iPSC البشري (hiPSC) مستعمرات باستخدام 0.5 ملي EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. افصل كتل hiPSC إلى خلايا مفردة عن طريق سحب العينة اللطيف. عد الخلايا للصيانة وزراعتها في الكاشف B (الجدول 1).
  3. في اليوم 0 ، قم بزرع 12,000 خلية / بئر في 96 بئرا مخروطية القاع على شكل حرف V لإعادة تجميع الخلايا في 100 ميكرولتر من وسط التمايز (الجدول 1).
  4. في اليوم 6 ، قم بسحب وسط زراعة الخلية بعناية وأضف 100 ميكرولتر من وسط التمايز الذي يحتوي على 20 ميكرومتر Y 27632 و 1.5 نانومتر (55 نانوغرام / مل) hBMP4.
  5. في اليوم 9 ، استبدل نصف وسط التمايز للحفاظ على تركيز hBMP4 عند حوالي 0.75 نانومتر.
  6. قم باستطاحة 60 ميكرولتر من وسط التمايز من كل بئر وأضف 60 ميكرولتر من وسط التمايز الطازج الذي يحتوي على 20 ميكرومتر Y-27632 لكل بئر.
  7. في اليوم 12 ، استبدل نصف وسط التمايز بوسط تمايز جديد لتحقيق 0.375 نانومتر hBMP4.
  8. في اليوم 18 ، انقل الركام إلى طبق بتري جديد بأطراف 10 مل وقم بتقطيع كل ركام إلى 2-4 قطع بسكين جراحي مجهري تحت مجهر مقلوب لتوليد المزيد من العضيات.
  9. انقل الركام من نفس المجموعة إلى أنبوب طرد مركزي واحد سعة 15 مل. عندما تستقر الركام في قاع الأنابيب ، استنشق المادة الطافية.
  10. أعد تعليق الركام ب 1 مل من وسط الشبكية العصبية (DMEM / F12 ، 10٪ مصل بقري للجنين ، مكمل N-2 1٪ ، 0.5 ميكرومتر حمض الريتينويك ، 0.1 ملي تورین ، 1٪ بنسلين ستربتومايسين) ، ونقلها إلى أطباق بتري غير لاصقة تحتوي على 15 مل من وسط الشبكية العصبية. ضع 10-15 عضوية شبكية العين في طبق بتري واحد.
  11. قم بتحديث وسط الثقافة كل 5 أيام. حافظ على الثقافة في الظلام لأن حمض الريتينويك حساس للضوء (الشكل 1) وتحقق من تكوين أنسجة الشبكية البشرية ذاتية التنظيم بمجهر مقلوب26،27،28،29.

3. تحليل عضيات الشبكية

  1. تلطيخ التألق المناعي لشبكية العين ثلاثية الأبعاد المشتقة من hiPSC
    1. قم بإصلاح شبكية العين ثلاثية الأبعاد في 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد طازج في DPBS لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ثم اشطف العضيات ب 1 مل من المخزن المؤقت DPBS.
    2. قم بقياس 0.5 غرام من الاغاروز (جدول المواد) ، واخلط مسحوق الاغاروز مع 100 مل من DPBS في قارورة يمكن وضعها في الميكروويف. استخدم الميكروويف لإذابة الاغاروز لمدة 1-3 دقائق حتى يذوب تماما. دع محلول الاغاروز يبرد إلى حوالي 40 درجة مئوية.
    3. قم بتضمينها في 2٪ في DPBS.
    4. قم بتقطيع العينات إلى أقسام بسمك 50 ميكرومتر باستخدام اهتزاز. ضع المقاطع المقطعة على شرائح مجهر الالتصاق (جدول المواد) وقم بتخزينها عند -80 درجة مئوية.
    5. قم بإذابة الشرائح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    6. اغسل الشرائح باستخدام DPBS لمدة 5 دقائق ، وكرر 3 مرات.
    7. استخدم 0.5٪ Triton X-100 في محلول DPBS لاختراق الشرائح لمدة 15 دقيقة في RT.
    8. قم بإزالة محلول النفاذية ، واغسل الشرائح باستخدام DPBS لمدة 5 دقائق ، وكرر 3 مرات.
    9. احتضن الشرائح مع 1٪ BSA و 0.5٪ Triton X-100 في DPBS لمدة 30 دقيقة في RT.
    10. احتضان الشرائح بجسم مضاد مضاد للرودوبسين (1: 1000) وجسم مضاد مضاد ل L / M opsin (1: 1000) مخفف في 1٪ BSA و 0.1٪ Triton X-100 لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    11. اغسل الشرائح باستخدام DPBS لمدة 5 دقائق ، وكرر 3 مرات.
    12. احتضان الشرائح بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر والأرانب للحمار (1: 500) مخفف في 1٪ BSA و 0.1٪ Triton X-100 لمدة ساعة واحدة في RT.
    13. أضف 30 نانومتر 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) في DPBS لمدة 15 دقيقة في RT للتلوين النووي.
    14. اغسل الشرائح باستخدام DPBS لمدة 5 دقائق ، وكرر 5 مرات.
    15. قم بتركيب الشرائح بوسيط التضمين (جدول المواد) وقم بتغطية الشرائح (جدول المواد). يحفظ في صندوق مظلم ويخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
  2. استخراج الحمض النووي الريبي وتسلسل الحمض النووي الريبي
    1. اجمع 1-3 (وفقا للأحجام) 3D شبكية العين المشتقة من كل عنصر تحكم ومريض في نفس النقاط الزمنية للتمايز (اليوم 0 ، اليوم 47 ، اليوم 91 ، اليوم 121 ، واليوم 151) في 1 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي (جدول المواد) على الجليد.
    2. استخدم الخالط (جدول المواد) لتعطيل العينات ، 1 دقيقة تشغيل ، 30 ثانية إيقاف تشغيل ، لمدة ثلاث دورات ، وتحقق من العينة بحثا عن الاضطراب.
    3. أوقف التجانس عندما تكون العينات متجانسة تماما ، وقم بتدوير الأنبوب بقوة لمدة 30 ثانية.
    4. احتضان العينات على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    5. قم بالطرد المركزي للعينات عند 13,800 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد خال من RNase سعة 2 مل.
    6. أضف 0.4 مل من الكلوروفورم إلى الأنبوب والدوامة وجهاز الطرد المركزي عند 13,800 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. انقل جزءا (حوالي 2/3) من المرحلة العلوية عديمة اللون إلى أنبوب جديد خال من RNase بعناية. لا تشنشق أو تزعج الواجهة البيضاء التي تحتوي على الحمض النووي.
    8. أضف 0.5 مل من الأيزوبروبانول البارد ، والدوامة لمدة 30 ثانية ، وجهاز الطرد المركزي عند 13,800 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تتشكل حبيبات على جانب قاع الأنبوب.
    9. قم بشفط المادة الطافية بعناية باستخدام طرف ماصة واحتفظ بالحبيبات.
      ملاحظة: حبيبات الحمض النووي الريبي تشبه الهلام وشفافة عندما يكون النقاء مرتفعا جدا.
    10. أضف 1 مل من الإيثانول البارد 70٪ ، وقم بدوامة العينات بقوة لمدة 30 ثانية ، وجهاز الطرد المركزي عند 13,800 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    11. قم بشفط المادة الطافية بعناية باستخدام طرف ماصة وجفف الحبيبات في الغطاء بالهواء عند RT لمدة 5-10 دقائق. لا تفرط في تجفيف الحبيبات.
    12. أضف 20-50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase وأعد تعليق الحبيبات بعناية عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
    13. ضع 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي على مقياس الطيف الضوئي (جدول المواد). تم استخدام ما مجموعه حوالي 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي من الضوابط والمرضى على التوالي لإعداد مكتبة Illumina30.
    14. قم بتخزين الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية.

النتائج

يصف الرسم التخطيطي إجراءات التمايز لتوليد عضيات شبكية صحية ومريضة مشتقة من iPSC (الشكل 1). من iPSC إلى ROs, يمكن إنتاج الاختلافات بسبب عدة عوامل. حالة iPSC هي الخطوة المحددة لتوليد RO. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بشدة بأن يقوم الباحثون بتسجيل كل خطوة وكتالوج وعدد دفعات ?...

Discussion

عضيات الشبكية هي هياكل ثلاثية الأبعاد مغلفة مشتقة من hiPSCs أو الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) وتتميز كنموذج واعد للغاية لتقليد الأنماط المكانية والزمانية لتطور الشبكية البشرية31،32. تتكون ROs من أنواع مختلفة من خلايا الشبكية ، بما في ذلك المستق?...

Disclosures

لا يكشف جميع المؤلفين عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر M.S. Yan-ping Li و Zhuo-lin Liu على دعمهما الفني وتعليقاتهما المفيدة فيما يتعلق بالمخطوطة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82171470 ، 31871497 ، 81970838 ، Z20J00122) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لبلدية بكين (Z200014 ، 82125007) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFA0105300).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96 V-bottomed conical wellsSumitomo BakeliteMS-9096VZ
A-83–01R&D Systems2939/10
Adhesion microscope slidesCITOtest188105
AgaroseGene Tech111760
Amaxa Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001Transfection system
B-27Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR&D Systems3718-FB
BlebbistatinNuwacell BiotechnologiesRP01008
Blood collection tubeBD Vacutainer EDTA366643
CHIR99021TOCRIS4423/10
Cover slidesCITOGLAS10212440C
cTarget hPSC MediumNuwacell BiotechnologiesRP01020
DAPIInvitrogenD-1306
DMEM/Ham’s F12Gibco10565-042
Donkey anti-mouse 488InvitrogenA-21202
Donkey anti-rabbit 594InvitrogenA-21207
EDTANuwacell BiotechnologiesRP01007
Embedding mediumFluorSaveTM Reagent345789
EX-CYTE growth enhancement mediumSigma811292Growth enhancement medium
Fetal bovine serumGibco04-002-1A
FicollSigma-Aldrich26873-85-8Density gradient medium
FLT3LPeprotech300-19
GlutaMAXLife Technologies35050-061L-glutamine supplement
HA-100STEMCELL Technologies72482
Ham’s F12Gibco11765-054
hLIFThermo Fisher ScientificAF-250-NA
HomogenizerEDEN labD-130
IL-3Peprotech213-13
IL-6Peprotech200-06
Iscove’s Modified Dulbecco MediumGibco12440053
KnockOut Serum Replacement - Multi-SpeciesGibcoA3181502Serum replacement media
L/M-opsinMilliporeab5405
MonothioglycerolSigmaM6145
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
Nanodrop SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND2000Spectrophotometer
ncEpic 125x SupplementNuwacell BiotechnologiesRP01001-02125x Supplement
ncEpic Basal MediumNuwacell BiotechnologiesRP01001-01Basal hpsc medium
ncLaminin511 human recombinant proteinNuwacell BiotechnologiesRP01025
PD0325901STEMCELL Technologies72182
Penicillin-streptomycinGibco15140-122
Recombinant human BMP4R&D Systems314-BP
Retinoic acidSigmaR2625
RhodopsinSigmaO4886
RNeasy Mini KitQiagen74104
RNeasy Mini KitQiagen74104
sIL6-RThermo Fisher ScientificRP-75602
StemSpan SFEM mediumSTEMCELL Technologies09600
TaurineSigmaT8691
Trizol reagentInvitrogen15596026
VitronectinNuwacell BiotechnologiesRP01002
V-Lance knifeAlcon Surgical8065912001

References

  1. Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
  2. Lin, Q., et al. Generation of nonhuman primate model of cone dysfunction through in situ AAV-mediated CNGB3 ablation. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 869-879 (2020).
  3. Zhou, M., Liu, Y., Ma, C. Distinct nuclear architecture of photoreceptors and light-induced behaviors in different strains of mice. Translational Vision Science & Technology. 10 (2), 37 (2021).
  4. Zito, I., et al. RPGR mutation associated with retinitis pigmentosa, impaired hearing, and sinorespiratory infections. Journal of Medical Genetics. 40 (8), 609-615 (2003).
  5. Solovei, I., et al. Nuclear architecture of rod photoreceptor cells adapts to vision in mammalian evolution. Cell. 137 (2), 356-368 (2009).
  6. Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A Comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), 0125631 (2015).
  7. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  8. Han, J. W., Yoon, Y. S. Induced pluripotent stem cells: Emerging techniques for nuclear reprogramming. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (7), 1799-1820 (2011).
  9. Kim, J. S., Choi, H. W., Choi, S., Do, J. T. Reprogrammed pluripotent stem cells from somatic cells. International Journal of Stem Cells. 4 (1), 1-8 (2011).
  10. Li, Y. P., Liu, H., Jin, Z. B. Generation of three human iPSC lines from a retinitis pigmentosa family with SLC7A14 mutation. Stem Cell Research. 49, 102075 (2020).
  11. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  12. Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 366 (2020).
  13. Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
  14. Deng, W. L., et al. Gene correction reverses ciliopathy and photoreceptor loss in iPSC-derived retinal organoids from retinitis pigmentosa patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
  15. Gao, M. L., et al. Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).
  16. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  17. Aasen, D. M., Vergara, M. N. New drug discovery paradigms for retinal diseases: A focus on retinal organoids. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 36 (1), 18-24 (2020).
  18. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  19. Anasagasti, A., Irigoyen, C., Barandika, O., Lopez de Munain, A., Ruiz-Ederra, J. Current mutation discovery approaches in Retinitis Pigmentosa. Vision Research. 75, 117-129 (2012).
  20. Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Genes and mutations causing autosomal dominant retinitis pigmentosa. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (10), 017129 (2014).
  21. Kortum, F., et al. X-linked retinitis pigmentosa caused by non-canonical splice site variants in RPGR. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 850 (2021).
  22. Megaw, R. D., Soares, D. C., Wright, A. F. RPGR: Its role in photoreceptor physiology, human disease, and future therapies. Experimental Eye Research. 138, 32-41 (2015).
  23. Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
  24. Liu, H., Hua, Z. Q., Jin, Z. B. Modeling human retinoblastoma using embryonic stem cell-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100444 (2021).
  25. Zhang, X. H., Xie, Y., Xu, K., Li, Y. Generation of an induced pluripotent stem cell line BIOi002-A from a patient with autosomal dominant optic atrophy. Stem Cell Research. 53, 102278 (2021).
  26. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  27. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286 (2015).
  28. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  29. Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
  30. Kumar, R., et al. A high-throughput method for illumina RNA-seq library preparation. Frontiers in Plant Science. 3, 202 (2012).
  31. Fligor, C. M., et al. Three-dimensional retinal organoids facilitate the investigation of retinal ganglion cell development, organization and neurite outgrowth from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 8 (1), 14520 (2018).
  32. Morizur, L., Herardot, E., Monville, C., Ben M'Barek, K. Human pluripotent stem cells: A toolbox to understand and treat retinal degeneration. Molecular and Cellular Neurosciences. 107, 103523 (2020).
  33. Bhatt, L., Groeger, G., McDermott, K., Cotter, T. G. Rod and cone photoreceptor cells produce ROS in response to stress in a live retinal explant system. Molecular Vision. 16, 283-293 (2010).
  34. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  35. Xue, Y., et al. Retinal organoids long-term functional characterization using two-photon fluorescence lifetime and hyperspectral microscopy. Frontiers in Cellular Neurosciences. 15, 796903 (2021).
  36. Colombo, L., et al. Comparison of 5-year progression of retinitis pigmentosa involving the posterior pole among siblings by means of SD-OCT: A retrospective study. BMC Ophthalmology. 18 (1), 153 (2018).
  37. Ferrari, S., et al. Retinitis pigmentosa: Genes and disease mechanisms. Current Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
  38. Shintani, K., Shechtman, D. L., Gurwood, A. S. Review and update: Current treatment trends for patients with retinitis pigmentosa. Optometry. 80 (7), 384-401 (2009).
  39. Wang, A. L., Knight, D. K., Vu, T. T., Mehta, M. C. Retinitis pigmentosa: Review of current treatment. International Ophthalmology Clinics. 59 (1), 263-280 (2019).
  40. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  41. Parfitt, D. A., et al. Identification and correction of mechanisms underlying inherited blindness in human iPSC-derived optic cups. Cell Stem Cell. 18 (6), 769-781 (2016).
  42. Shimada, H., et al. In vitro modeling using ciliopathy-patient-derived cells reveals distinct cilia dysfunctions caused by CEP290 mutations. Cell Reports. 20 (2), 384-396 (2017).
  43. Deretic, D., Wang, J. Molecular assemblies that control rhodopsin transport to the cilia. Vision Research. 75, 5-10 (2012).
  44. Rao, K. N., Li, L., Anand, M., Khanna, H. Ablation of retinal ciliopathy protein RPGR results in altered photoreceptor ciliary composition. Scientific Reports. 5, 11137 (2015).
  45. Zhang, X., Wang, W., Jin, Z. B. Retinal organoids as models for development and diseases. Cell Regeneration. 10 (1), 33 (2021).
  46. Zhang, X. H., Jin, Z. B. Patient iPSC-derived retinal organoids: Observable retinal diseases in-a-dish. Histology and Histopathology. 36 (7), 705-710 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

RP IPSC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved