Farelerde Travmatik Periferik Sinir Yaralanması

Mevcut protokol, farelerde siyatik sinirin aşılı ve aşısız boşluklarının yanı sıra hassas kalibre edilmiş ezilme, sıkı hizalanmış ve yanlış hizalanmış laserasyon dahil olmak üzere travmatik periferik sinir yaralanmalarını (TPNI'ler) tanımlar. Özel olarak tasarlanmış sensörler, TPNI sonrası tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için yaygın olarak bulunan araçlarla indüklenen sinir travmasını ölçmek için geliştirilmiştir.

Travmatik periferik sinir yaralanması (TPNI) ortopedik travma sonrası sık görülen bir morbidite nedenidir. Sinir ve denerve kas yaralanması için tekrarlanabilir ve kesin yöntemler kas-iskelet sistemi araştırmalarında uzun zamandır bir hedef olmuştur. Travmatik olarak yaralanan birçok uzuv, uzun vadeli hasta sonucunu tanımlayan sinir travmasına sahiptir. Birkaç yıl boyunca, ezilme, laserasyonlar ve sinir boşluğu greftleme dahil olmak üzere mikrocerrahi sinir yaralanmaları üretmek için kesin yöntemler geliştirilmiştir ve tekrarlanabilir sonuç değerlendirmelerine olanak tanır. Ayrıca, insan hastaları değerlendirmek için kullanılan sonuçlarla klinik olarak anlamlı korelasyonlar sunan kalibre edilmiş ezilme yaralanmaları için daha yeni yöntemler oluşturulmuştur. Sinir yaralanmasında düşük değişkenliği sağlamak için minimal manipülasyon ilkeleri, bu modellere daha fazla ilişkili doku yaralanmasının eklenmesine izin verir. Bu, doğrudan kas ezilmesini ve uzuv yaralanmasının diğer bileşenlerini içerir. Son olarak, atrofi değerlendirmesi ve davranışsal sonuçların kesin analizi, bu yöntemleri, insan travmatik uzuv yaralanmasının tüm unsurlarını gerçekçi bir şekilde içeren kas-iskelet sistemi travmasını incelemek için eksiksiz bir paket haline getirir.

Travmatik periferik sinir yaralanması (TPNI) ortopedik travma^sonrası sık görülen bir morbidite nedenidir ^1,2,3. Her yıl, travma hastalarının yaklaşık% 3'ü sinir yaralanması^{geçirir 1,4}, 3,50,000 vaka^{insidansında 5, 50,000} cerrahi onarım^{ile sonuçlanır 6}. TPNI'ler geniş bir şiddet aralığında ortaya çıkar ve fonksiyonel iyileşme doğrudan bu yaralanmaların tipine ve ciddiyetine bağlıdır ^7,8,9. Daha az şiddetli travma (ör.hafif ezilme, eksik yırtılma, vb.) önce miyelin kılıfına ve aksonlara zarar verirken, daha şiddetli kuvvetler (ör. şiddetli ezilme, tam yırtılmalar, vb.) bağ sinir dokularını bozacaktır; Örneğin, miyelin ve aksonlara ek olarak endoneurium, perineurium ve epineurium ^1,10. TPNI'li hastalar, sinir fonksiyonunun sonunda geri döneceğini ve kas atrofisinin tersine döneceğini umarlar. Onlarca yıllık araştırmalar, tedavi prosedürlerindeki ilerlemelere rağmen tam iyileşmeyi artırmak veya sağlamak için kesin tedaviler sağlamamıştır^11,12.

Sinir transeksiyonları, genellikle mikroskop altında yapılan cerrahi onarım olmadan iyileşmez. Onarımlar tipik olarak uçtan uca gerçekleştirilir ve onarım sahasının gerilim altında olmamasını sağlamak için çaba sarf edilir. Onarımların gerilimsiz olmasını sağlamak için sinir grefti kullanılır^13,14. Bu onarımlarda kullanılan görünüşte gelişmiş yöntemlere rağmen, fonksiyonel iyileşme genellikle etkileyici değildir^11,12. Rehabilitasyon genellikle eksik ve tatmin edici değildir. Optimal fonksiyonel iyileşme, yaralanma bölgesini (sinir köprüsü) geçmek ve hedef organı innerve etmek için rejenere aksonları gerektirir. Bu süreçler, aksonal yanlış yönlendirme veya büyüme bodurluğu ile karmaşıklaşır, bu da kas atrofisi ve nihayetinde iyileşmede başarısızlık ile sonuçlanır 15,16,17,18. Sinir onarımını takiben fonksiyonel sonuçların (örn. uçtan uca dikiş, izogreftleme vb.) fasiküler appozisyonun doğruluğuna bağlı olduğu gösterilmiştir^19,20. Kesilen sinir kütüklerinin ve fasiküllerinin uygun yönlülüğü bu nedenle sinir onarımında kritik öneme sahiptir, bu olmadan optimal aksonal rejenerasyonda bile zayıf fonksiyonel iyileşme beklenebilir. Mikrocerrahi sütür onarımının kendisi travmatik bir süreçtir ve sonuçları büyük ölçüde iyileştirmek için yeni yöntemler açısından çok az şey meydana gelmiştir. Alan, tekrarlanabilir sinir transeksiyonu hayvan modellerinden yoksundur, bu da fonksiyonel ve doku düzeyinde güvenilir iyileşme ölçümlerine izin veren öngörülebilir boşluklarla sonuçlanır. Bu tür yöntemler, eğer mevcutsa, nöral vaskülarizasyondaki değişken değişiklikler ve denervasyon sonrası atrofi^21,22 sorunları olmadan sinir rejenerasyonunun karakterizasyonuna izin verecektir. Birçok grup, bu tür değişkenliği sınırlayan daha iyi modeller kullanmaya çalışır. Bunun bir yolu, sinir onarımlarının minimal düzeyde manipüle edilmesini ve sinir kütüklerinin mükemmel bir şekilde karşı karşıya getirilmesini sağlamaktır.

Bu en iyi şekilde, kademeli kesme ve fibrin yapıştırıcısı (STG) adı verilen standartlaştırılmış bir periferik sinir transeksiyonu tekniği kullanılarak gerçekleştirilir. Bu STG modelindeki onarımlar fibrin yapıştırıcı ile sabitlenmiş ve boşluk mesafeleri standartlaştırılmış ve en aza indirilmiştir^21,22. Fibrin yapıştırıcısının kendisi insanlarda bu onarımlar için, muhtemelen aynı nedenlerle, onarım sonrası yara izi oluşumu üzerindeki yararlı etkileriyle birlikte kullanılır^23,24. Mevcut yöntemin anahtarı, sinir onarımının yırtılma tamamlanmadan önce başlaması ve sabit bir yaralanma paterni sağlamasıdır. Bu güncel yöntem, altın standart epinöral sütürleme ile sinir transeksiyonunun karakteristik patofizyolojisi ile yakın bir ortaklık sergiledi ve fibrin yapıştırıcısının sinir rejenerasyonu üzerine olumsuz etkisi gözlenmedi. Farelerde siyatik sinir transeksiyonunun fibrin yapıştırıcısı ile onarılması, sütürleme yoluyla erken sinir rejenerasyonuna kıyasla aksonun uzamasını iyileştirir ve bu bulgular STG ile tutarlıdır. STG ayrıca sütür konumlandırma için sinire asla dokunulmayan minimal manipülasyon prensibinden de yararlanır²¹. Bu, modeldeki onarım ile ilişkili sinir travmasını etkili bir şekilde standardize eder. ^22'yi yapıştırmadan önce siniri çevirerek yanlış hizalamayı araştırmak için benzer ilkeler kullanıldı. Bu, neredeyse aynı miktarda manipülasyonun, artan boşluk veya travma olmaksızın hizalama farklılıklarına katkıda bulunduğu sinir yaralanmalarının doğrudan karşılaştırılmasına izin verdi. Bu, hizalamanın sinir yaralanmasına bağlı nörovasküler değişiklikler^21,22, kas atrofisi ^21,22 ve fonksiyonel iyileşme ^21,22 üzerindeki etkisinin doğrudan incelenmesini kolaylaştırdı. Mevcut araştırma, kasıtlı ve kesin olarak yanlış hizalanmış sinir kütüklerinin incelenmesine izin veren tek şeydir.

TPNI'deki sinirlerin çoğu kopmamıştır, herhangi bir boşluk veya kusur yoktur ve iyileşme yeteneğine sahip gibi görünmektedir ve yine de bu vakaların çoğunda, uzuvlar sinir yaralanmaları ve kafa karıştırıcı müdahaleler nedeniyle kalıcı olarak işlevsiz kalmaktadır. Deneysel TPNI'ler geleneksel olarak kemirgen siyatik sinir ezilme yaralanmaları (SNCI'ler) üzerinde kilitleme iğnesi sürücüleri (ND'ler), forseps veya benzer cihazlar ve kesin ve tekrarlanabilir bir ezilme yaralanması oluşturmak için deneyimli bir cerrah kullanılarak gerçekleştirilir 25,26,27,28,29,30. SNCI hayvan modelleri, basınç değişimini sınırlamak için doğuştan gelen operatör hassasiyetine bağlıdır, ancak bu hiçbir zaman açık bir şekilde ölçülmez. Bu, standartlaştırılmış basınç hakkında net bir rehberlik olmaksızın hayvanlar ve çalışmalar arasında değişkenliğe neden olur. Bu nedenle, bilinen çeşitli yoğunluklara sahip tutarlı, doğru bir dizi yaralanmayı hassas bir şekilde sunma ve raporlama yeteneğinin TPNI alanına fayda sağlayabileceği tahmin edilmektedir. Mükemmel bir model, otantik çalışmalar arası ve cihaz tekrarlanabilirliği için herhangi bir laboratuvar veya araştırmacı tarafından her hayvana bilinen bir sinir hasarı ciddiyetinin SNCI'sini sağlayabilir. Bu eksikliği gidermek için, bir sinire uygulanan basıncı (gerçek zamanlı) raporlamada yetkin bir Kuvvete Duyarlı Direnç (FSR) içeren benzersiz bir kalibre edilmiş dijital cihaz inşa edildi. Bu cihaz daha sonra çeşitli forseps ve ND'ler³¹ tarafından uygulanan çeşitli ezilme yaralanması basınçlarının tekrarlanabilirliği açısından test edildi.

Son olarak,^{sinir 32'deki} boşlukları gidermek için özel bir yöntem geliştirildi. Literatürdeki sinir boşlukları, bir sinir bölümünün çıkarılması ve daha sonra defekte geri onarılmasıyla indüklenir 13,33,34. Bu cerrahi prosedür için gerekli olan manipülasyon genellikle dikiş ile birleştirilir ve sinirin kütükleri değişken olarak geri çekilir 21,32,34. İzojenik büyük boyutlu sinir greftleri kullanıldığında, sinir güdük retraksiyonunun hiçbir zaman^{bir sorun olmayacağı} mantığına dayanıyordu. Yöntem, aynı anda iki veya üç hayvan üzerinde aynı anda çalışmayı ve başka bir hayvanda indüklenen 5 mm'lik bir kusura yerleştirmek için 7 mm'lik bir greft almayı gerektiriyordu. İkinci hayvanın kusur boyutu daha sonra gerekirse başka bir hayvanda daha küçük bir kusuru aşılamak için kullanıldı. Bu, gerilimsiz onarım sağlamak için her zaman sinir kusurundan daha büyük olan donör sinirlerle greft defektlerine eş zamanlı cerrahi için kapsamlı bir yöntemle sonuçlandı. Minimal manipülasyon gerekliliği ile birleştiğinde, bu, literatürde her yerde bulunan asimetrik aşı boşlukları olmayan sinjeneik hayvanlarda doğrudan aşı uzunluğunu incelemek için bir yol sunar 20,32,34.

Deneysel tasarım ve hayvan protokolleri, Penn State Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Çalışmalar için 10 haftalık, 20-25 g ağırlığındaki yetişkin C57BL / 6J erkek fareler kullanıldı. Hayvanlar, steril hayvan yönetimi koşullarında hayvan tesisinde barındırıldı ve çalışmalar yapılmadan en az 5 gün önce iklimlendirildiler.

1. Hayvan hazırlama

1. 26 G'lik bir iğne kullanılarak intraperitoneal enjeksiyon yoluyla bir ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) kokteyli kullanarak hayvanları derinlemesine uyuşturun.
2. Hayvanların sağ arka bacaklarını ve alt sırtını bir düzeltici kullanarak tıraş edin ve ardından steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak% 10 povidon-iyot çözeltisi ile hazırlanmış alkolle temizleyin (bkz.
3. Gözlerin kuruluğunu önlemek için steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak gözlere oftalmik kayganlaştırıcı merhem sürün.
4. Hazırladıktan sonra, vücut ısısını 37 °C'de tutmak için hayvanları homeotermik bir ısıtma yastığına (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
5. Farelerin arka bacaklarını ısıtma yastığının üzerine bantlayın ve diz eklemi vücutla dik bir açı yapacak şekilde simetrik olarak dikkatlice konumlandırın.
6. Tüm cerrahi aletleri otoklavlama ile sterilize edin ve ardından steril pedin üzerine yerleştirin.
   NOT: Cerrah ameliyatları gerçekleştirmeden önce steril maske, önlük ve eldiven giymelidir.

2. Travmatik Periferik Sinir Yaralanması (TPNI) model oluşturma

1. Hazırlıktan sonra, bir makas ve hassas bir stereo zoom dürbün mikroskobu kullanarak uyluk kemiğinin uzunluğu boyunca yanal bir cilt kesisi (~ 2 cm) yapın (bkz. Malzeme Tablosu).
2. Siyatik siniri (SN) diseksiyon makası ve mikrocerrahi forseps kullanarak iliotibial banttan künt bir şekilde açığa çıkarın. SN'de herhangi bir iyatrojenik mekanik hasardan kaçının.
3. TPNI ameliyatlarından sonra cildi cerrahi zımbalarla kapatın (adım 4-9). Yavaş salınan buprenorfini (0.05 mg / kg) (Malzeme Tablosuna bakınız) tüm hayvanlara analjezik olarak deri altından uygulayın.
4. Aşağıdaki adımları izleyerek Siyatik Sinir Ezilme Yaralanması (SNCI) gerçekleştirin.
   1. SN'yi forseps uçları arasındaki düz şekilde trifurkasyona yaklaşık 3 mm proksimalde yerleştirin (Şekil 1A).
      NOT: Hayvanlar/gruplar arasında deney sonuçlarında farklılıklar getiren şekilsiz pozisyondan kaçınmak için son derece dikkatli olunmalıdır.
   2. Sabit bir genişlik (1 mm) üzerinde belirli bir basınç elde etmek için kalibre edilmiş forseps ve özel alüminyum mastarlar (Şekil 31,35C)^3.5 kullanarak SNCI'yi gerçekleştirin.
      NOT: Kalibre edilmiş forseps ve özel delik işleme mastarları kullanan SNCI için dijital basınç sensörü cihazının detayları daha önce yayınlanan raporlarımızda^31,35 belirtilmiştir. Özel mastarlar, küçük alüminyum parçalarında delikler açılarak yapıldı. Bu mastarların, kamuya açık olan ve daha önce açıklanan parçalar ve spesifikasyonlar kullanılarak bir dijital basınç sensörü kullanılarak belirli basınçlar ürettiği onaylanmıştır^31,35.
   3. Konumlandırmadan sonra, forseps üzerindeki bloğa ulaşmak için jig'i nazikçe itin ve 30 saniye sonra jig'i yavaşça serbest bırakın ve sinirin değişen yapısı ile yaralanmayı onaylayın (Şekil 1B).
      NOT: Sinirin yapısal değişiklikleri, yaralanma ciddiyetinin derecesini doğrular. Bu, deneme vakalarında mikroskopi kullanılarak doğrulanabilir.
   4. SNCI'den sonra, bir cerrah tarafından iyatrojenik yaralanmayı önlemek için siniri kaslar arasına dikkatlice gömün.
      NOT: Kalibre edilmiş forsepslerin neden olduğu ezilme yaralanmaları kesin, güvenilir ve tekrarlanabilirdi, bu da hassas sıkıştırma basınç sensörü cihazı³¹ kullanılarak belirlendi (Şekil 1D). Forseps ile farklı jig ile gerçek zamanlı ezilme yaralanma basıncının zaman seyri Şekil 2A,B'de gösterilmiştir.
5. Transeksiyon ve Tutkal (TG) yapın.
   1. Diseksiyon makası kullanarak SN'yi SN trifurkasyonuna tamamen ~ 3 mm proksimalden geçirin.
   2. Transeksiyondan sonra, kopmuş sinir uçlarının daha fazla yer değiştirmesini sınırlamak için transeksiyon bölgesinin etrafına 10 μL fibrin yapıştırıcısı ( Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayarak sinir boşluğunu anında onarın. Fibrin yapıştırıcısının pıhtılaşma süresi ~ 15 s idi.
      NOT: SN aralığı, retraksiyon nedeniyle transeksiyondan sonra kontrolsüz ve gelişigüzeldi, bu da ortaya çıkan sonuç için bir değişken olabilir.
6. Kademeli Transeksiyon ve Tutkal (STG) gerçekleştirin.
   1. Boşluk oluşumunu önleyen diseksiyon makası kullanarak SN trifurkasyonuna ~ 3 mm proksimalde SN'yi eksik (genişliğinin% 80'i) geçirin.
   2. Daha sonra, kesilen bölgenin etrafına 10 μL fibrin yapıştırıcısı uygulayın ve yapıştırıcının tamamen pıhtılaşmasından (~ 10 s) önce sinirin kalan% 20'sini tamamen kesin.
      NOT: Bu yöntem, kesilen sinir uçlarının elastik retraksiyonunun neden olduğu boşluk oluşumunu etkili bir şekilde azalttı, ancak TG modelinden farklı olarak sinire ek cerrahi manipülasyondan da muaftı (Şekil 3A).
7. Tutkal ile Çevirme ve Dönüştürme (FTG) gerçekleştirin.
   1. İlk olarak, SN'yi her iki taraftan genişliğinin %40'ına kadar kesin (Şekil 3B).
   2. Distal kütüğü enine çevirin ve transeksiyon bölgesinin etrafına 10 μL fibrin yapıştırıcısı uygulayın.
   3. Daha sonra, fibrin yapıştırıcısının tamamen pıhtılaşmasından (~ 10 s) önce merkezi% 20 siniri tamamen kesin.
   4. Doğrudan mikroskop altında tam transeksiyonu onaylayın.
8. Aşağıdaki adımları izleyerek sinir boşluğu ve greftleme işlemini gerçekleştirin.
   1. Kademeli bir sinir boşluğu ve aşılama modelinde, 1 deney setinde³² kaskad sinjeneik sinir greftlemesi için seri olarak fare çiftleri kullanın.
   2. Bir farede (örneğin, fare # 1), sağ SN'de 7 mm (G-7 / 0) sinir boşluğu oluşturun, burada sinir, SN trifurkasyonunun ~ 3 mm proksimalinde ve steril dereceli bir ölçek kullanılarak bundan 7 mm uzakta diseke edildi (Şekil 3C).
      NOT: 7 mm'lik siyatik sinirin greftleme yapılmadan diseke edilmesiyle onarılamaz bir sinir boşluğu oluşturuldu. Bu fare G-7/0 olarak etiketlenmiştir çünkü 7 mm'lik bir greft alınır, ancak onarım yapılmaz.
   3. Diseksiyondan sonra, kesilen siniri hemen fosfat tamponlu salin (PBS) içeren Petri kabının steril durumuna aktarın ve SN'nin proksimal kütüğünü (fare # 1) 10 μL fibrin yapıştırıcı ile kasın altına gömün.
   4. Daha sonra, fare # 2'de, sağ SN'de 5 mm'lik bir sinir boşluğu oluşturun ve her iki uçta fibrin yapıştırıcısı (10 μL, ~ 10 s) kullanarak fare # 1'den 7 mm'lik diseke sinir bölümünü greftleyin (G-5 / 7) (Şekil 3C).
      NOT: Greftleme sırasında, cerrah tarafından SN'nin yanlış hizalanmalarını ve diğer iyatrojenik yaralanmalarını önlemek için özel dikkat gösterilmelidir.
9. Kademeli Transeksiyon ve Sütürler (STS) gerçekleştirin.
   1. Siyatik siniri genişliğinin %80'i boyunca şiddetli hale getirin (Şekil 3D) ve 9-0 naylon epinöral dikişler kullanarak kütükleri onarın.
   2. Tamamlandıktan sonra, sinirin kalan kısmını şiddetlendirin ve tek bir 9-0 naylon dikiş kullanarak onarın.
   3. Yırtılmanın arka tarafını ortaya çıkarmak için siniri ters çevirin ve onarımı tamamlamak için iki adet 9-0 naylon dikiş kullanın.

Özel yapım dijital basınç sensörü cihazı (Şekil 1D), bir kuvvet uygulandığında FSR'nin direncindeki değişikliği algılayarak çalışır. Bu cihaz, <5 μs'lik bir tepki süresi, 20 Hz'lik bir örnekleme hızı ve 2.5-25 lbs'lik bir basınç aralığı ile kendisine uygulanan en mütevazı basınç miktarlarını algılar ve kaydeder³¹. Basınç sensör cihazı (Şekil 1D) tarafından algıla...

TPNI araştırmasının tarihi birkaç on yıla yayılmaktadır^11,12. Köpekler ve daha büyük türlerle yapılan erken deneyler, TPNI sonuçlarının^{çalışmasında} hayvan modellerinin önemini ortaya koymuştur 36,37,38. Zamanla, bu modeller, yerleşik ve yaygın olarak kullanılan doğrulanmış sonuç ölçümleri

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma, NIH (K08 AR060164-01A) ve DOD (W81XWH-16-1-0725; W81XWH-19-1-0773) Pennsylvania Eyalet Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hershey, PA 17033, ABD'nin kurumsal desteğine ek olarak.