Lésion traumatique des nerfs périphériques chez la souris

Le présent protocole décrit les lésions traumatiques des nerfs périphériques (TPNI), y compris l’écrasement calibré avec précision, la lacération strictement alignée et mal alignée, ainsi que les espaces greffés et non greffés du nerf sciatique chez la souris. Des capteurs conçus sur mesure sont développés pour évaluer les traumatismes nerveux, induits à l’aide d’outils couramment disponibles afin de garantir des résultats post-TPNI reproductibles.

Les lésions traumatiques des nerfs périphériques (TPNI) sont une cause fréquente de morbidité après un traumatisme orthopédique. Les méthodes reproductibles et précises pour blesser les nerfs et les muscles dénervants sont depuis longtemps un objectif de la recherche musculo-squelettique. De nombreux membres traumatisés ont un traumatisme nerveux qui définit l’issue à long terme du patient. Pendant plusieurs années, des méthodes précises de production de lésions nerveuses microchirurgicales ont été développées, notamment l’écrasement, les lacérations et la greffe d’espace nerveux, permettant des évaluations reproductibles des résultats. De plus, de nouvelles méthodes sont créées pour les blessures par écrasement calibrées qui offrent des corrélations cliniquement pertinentes avec les résultats utilisés pour évaluer les patients humains. Les principes de manipulation minimale pour assurer une faible variabilité des lésions nerveuses permettent d’ajouter encore plus de lésions tissulaires associées dans ces modèles. Cela inclut l’écrasement musculaire direct et d’autres composantes des blessures aux membres. Enfin, l’évaluation de l’atrophie et l’analyse précise des résultats comportementaux font de ces méthodes un ensemble complet pour l’étude des traumatismes musculo-squelettiques qui intègre de manière réaliste tous les éléments des lésions traumatiques des membres humains.

Les lésions traumatiques des nerfs périphériques (TPNI) sont une cause fréquente de morbidité après un traumatisme orthopédique ^1,2,3. Chaque année, environ 3 % des patients traumatisés souffrent de lésions nerveuses ^1,4, avec une incidence de 3 50 000 cas⁵, entraînant 50 000 réparations chirurgicales⁶. Les traumatismes traumatiques aigus se produisent dans un large éventail de gravités, et la récupération fonctionnelle dépend directement du type et de la gravité de ces lésions ^7,8,9. Les traumatismes moins graves (par exemple, un léger écrasement, une lacération incomplète, etc.) blesseront d’abord la gaine de myéline et les axones, tandis que les forces plus graves (par exemple, un écrasement sévère, des lacérations complètes, etc.) perturberont les tissus du nerf conjonctif ; Par exemple, l’endoneurium, le périneurium et l’épineurium en plus de la myéline et des axones ^1,10. Les patients atteints de TPNI espèrent que la fonction nerveuse finira par revenir et que l’atrophie musculaire sera inversée. Des décennies de recherche n’ont fourni aucun traitement précis pour améliorer ou assurer une récupération complète, malgré les progrès des procédures de traitement^11,12.

Les transsections nerveuses ne guérissent pas sans une réparation chirurgicale, qui est souvent effectuée au microscope. Les réparations sont généralement effectuées de bout en bout, en s’efforçant de s’assurer que le site de réparation n’est pas sous tension. La greffe nerveuse est utilisée pour s’assurer que les réparations sont sans tension^13,14. Malgré les méthodes apparemment avancées utilisées dans ces réparations, la récupération fonctionnelle n’est généralement pas impressionnante^11,12. La réhabilitation est souvent incomplète et insatisfaisante. La récupération fonctionnelle optimale nécessite la régénération des axones pour traverser le site de la blessure (pont nerveux) et innerver l’organe cible. Ces processus sont compliqués par une mauvaise direction axonale ou un retard de croissance, entraînant une atrophie musculaire et un échec final de récupération 15,16,17,18. Il a été démontré que les résultats fonctionnels après une réparation nerveuse (par exemple, suture de bout en bout, isogreffe, etc.) dépendent de la précision de l’apposition fasciculaire^19,20. La directionnalité correcte des moignons nerveux transectés et de leurs fascicules est donc essentielle à la réparation nerveuse, sans laquelle une mauvaise récupération fonctionnelle peut être attendue même avec une régénération axonale optimale. La réparation microchirurgicale des sutures est elle-même un processus traumatisant, et peu de nouvelles méthodes ont été mises en place pour améliorer considérablement les résultats. Le domaine manque de modèles animaux reproductibles de section nerveuse, ce qui entraîne des lacunes prévisibles permettant des mesures de récupération fiables au niveau fonctionnel et tissulaire. De telles méthodes, si elles étaient disponibles, permettraient de caractériser la régénération nerveuse sans les problèmes de changements variables dans la vascularisation neurale et l’atrophie post-dénervation^21,22. De nombreux groupes s’efforcent d’utiliser de meilleurs modèles qui limitent ce type de variabilité. Une façon est de s’assurer que les réparations nerveuses sont manipulées au minimum et que les moignons nerveux sont parfaitement opposés.

La meilleure façon d’y parvenir est d’utiliser une technique standardisée de transsection des nerfs périphériques appelée coupe par étapes et colle de fibrine (STG). Les réparations dans ce modèle STG sont sécurisées avec de la colle de fibrine, et les distances d’espace sont normalisées et minimisées^21,22. La colle de fibrine elle-même est utilisée chez l’homme pour ces réparations, probablement pour les mêmes raisons, ainsi que ses effets bénéfiques sur la formation de cicatrices post-réparation^23,24. La clé de la méthode actuelle est que la réparation nerveuse commence avant la fin de la lacération, assurant un schéma de blessure fixe. Cette méthode actuelle présentait une similitude étroite avec la physiopathologie caractéristique de la section nerveuse avec la suture épineurale de référence, et l’impact négatif de la colle de fibrine n’a pas été observé sur la régénération nerveuse. La réparation de la section du nerf sciatique avec de la colle de fibrine chez la souris améliore l’allongement de l’axone par rapport à la régénération nerveuse précoce par suture, et ces résultats sont cohérents avec STG. STG bénéficie également du principe de manipulation minimale, où le nerf n’est jamais touché pour le positionnement de la suture²¹. Cela normalise efficacement le traumatisme nerveux associé à la réparation dans le modèle. Des principes similaires ont été utilisés pour étudier le désalignement en retournant le nerf avant de coller²². Cela a permis une comparaison directe des lésions nerveuses où presque la même quantité de manipulation a contribué à des différences d’alignement sans augmentation de l’écart ou du traumatisme. Cela a facilité l’examen direct de l’effet de l’alignement sur les modifications neurovasculaires induites par les lésions nerveuses^21,22, l’atrophie musculaire^21,22 et la récupération fonctionnelle^21,22. La présente investigation est tout ce qui permet d’étudier les moignons nerveux délibérément et précisément désalignés.

La plupart des nerfs de la TPNI ne sont pas sectionnés, n’ont pas d’espace ou de défaut et semblent être capables de se rétablir, et pourtant, dans beaucoup de ces cas, les membres restent dysfonctionnels en permanence à cause de lésions nerveuses et d’interventions confondantes. Les TPNI expérimentaux sont généralement effectués sur des blessures par écrasement du nerf sciatique (SNCI) chez les rongeurs à l’aide d’un tourne-aiguille de verrouillage (ND), de pinces ou de dispositifs similaires, et d’un chirurgien expérimenté pour créer une blessure par écrasement précise et reproductible 25,26,27,28,29,30 . Les modèles animaux SNCI dépendent de la précision innée de l’opérateur pour limiter les variations de pression, mais celle-ci n’est jamais mesurée explicitement. Il en résulte une variabilité entre les animaux et les études, sans indication claire sur la pression standardisée. On s’attend donc à ce que la capacité de livrer et de signaler avec précision une série cohérente et précise de blessures avec diverses intensités connues puisse bénéficier au domaine TPNI. Un modèle parfait peut fournir un SNCI d’une gravité de lésion nerveuse connue pour chaque animal par n’importe quel laboratoire ou chercheur pour une inter-étude authentique et une reproductibilité du dispositif. Pour remédier à cette lacune, un appareil numérique calibré unique a été construit, contenant une résistance sensible à la force (FSR), capable de signaler la pression (en temps réel) appliquée à un nerf. Ce dispositif a ensuite été testé pour la reproductibilité de diverses pressions de blessure par écrasement déployées par divers types de forceps et de ND³¹.

Enfin, une méthode spécifique a été développée pour traiter les lacunes dans le nerf³². Dans la littérature, les trous nerveux sont induits par l’ablation d’une section nerveuse, puis par sa réparation dans le défaut 13,33,34. La manipulation requise pour cette intervention chirurgicale est souvent aggravée par des sutures, et les moignons du nerf se rétractent de manière variable 21,32,34. Il était basé sur le raisonnement selon lequel l’utilisation de greffes nerveuses isogéniques surdimensionnées, la rétraction du moignon nerveux ne sera jamais un problème³². La méthode nécessitait l’opération simultanée sur deux ou trois animaux à la fois, en prenant un greffon de 7 mm pour le placer dans un défaut de 5 mm induit chez un autre animal. La taille du défaut du deuxième animal a ensuite été utilisée pour greffer un défaut encore plus petit chez un autre animal si nécessaire. Cela a abouti à une méthode complète de chirurgie simultanée pour greffer les défauts avec des nerfs donneurs qui sont toujours plus gros que le défaut nerveux afin d’assurer une réparation sans tension. Combiné à l’exigence d’une manipulation minimale, cela offre une voie pour étudier la longueur des greffons directement chez les animaux syngéniques sans espaces de greffon asymétriques qui sont omniprésents dans la littérature 20,32,34.

La conception expérimentale et les protocoles sur les animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de la faculté de médecine de l’Université Penn State. Des souris mâles C57BL/6J adultes, âgées de 10 semaines, pesant de 20 à 25 g, ont été utilisées pour les études. Les animaux ont été logés à l’animalerie dans des conditions de gestion stériles, et ils ont été acclimatés au moins 5 jours avant de mener les études.

1. Préparation des animaux

1. Anesthésier profondément les animaux à l’aide d’un cocktail de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) par injection intrapéritonéale à l’aide d’une aiguille de 26 G.
2. Rasez l’arrière droit et le bas du dos de l’animal à l’aide d’une tondeuse, puis nettoyez avec de l’alcool préparé avec une solution de povidone iodée à 10 % à l’aide d’applicateurs stériles à embout de coton (voir le tableau des matériaux).
3. Appliquez une pommade lubrifiante ophtalmique sur les yeux à l’aide d’applicateurs stériles à embout de coton pour éviter la sécheresse oculaire.
4. Après la préparation, placez les animaux sur un coussin chauffant homéothermique (voir tableau des matériaux) pour maintenir la température corporelle à 37 °C.
5. Collez les membres postérieurs des souris sur le coussin chauffant et positionnez-les soigneusement symétriquement de manière à ce que l’articulation du genou forme un angle droit avec le corps.
6. Stérilisez tous les outils chirurgicaux par autoclavage, puis placez-les sur le tampon stérile.
   REMARQUE : Le chirurgien doit porter un masque stérile, une blouse et des gants avant d’effectuer des interventions chirurgicales.

2. Génération de modèles de lésions nerveuses périphériques traumatiques (TPNI)

1. Après la préparation, faites une incision cutanée latérale (~2 cm) sur toute la longueur du fémur à l’aide de ciseaux et d’un microscope binoculaire à zoom stéréo de précision (voir tableau des matériaux).
2. Exposez brutalement le nerf sciatique (SN) à travers la bande ilio-tibiale à l’aide de ciseaux de dissection et d’une pince microchirurgicale. Évitez tout dommage mécanique iatrogène au SN.
3. Fermez la peau avec des agrafes chirurgicales après les chirurgies TPNI (étapes 4 à 9). Administrer de la buprénorphine à libération lente (0,05 mg/kg) (voir le tableau des matières) par voie sous-cutanée à tous les animaux en tant qu’analgésique.
4. Effectuez une blessure par écrasement du nerf sciatique (SNCI) en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Positionnez le SN à environ 3 mm à proximité de la trifurcation dans la forme plate entre les pointes des pinces (Figure 1A).
      REMARQUE : Il faut faire très attention à éviter la difforme, ce qui entraîne des variations dans les résultats expérimentaux entre les animaux/groupes.
   2. Effectuer le SNCI à l’aide d’une pince calibrée et de gabarits en aluminium personnalisés (Figure 1C)^31,35 pour obtenir une pression spécifique sur une largeur fixe (3,5 mm).
      REMARQUE : Les détails de l’appareil de capteur de pression numérique pour SNCI à l’aide de pinces calibrées et de gabarits d’alésage personnalisés sont mentionnés dans nos rapports précédemment publiés^31,35. Des gabarits personnalisés ont été fabriqués en perçant des trous dans de petits morceaux d’aluminium. Il est confirmé que ces gabarits produisent des pressions spécifiques à l’aide d’un capteur de pression numérique, en utilisant des pièces et des spécifications accessibles au public et décrites précédemment^31,35.
   3. Après le positionnement, poussez doucement le gabarit pour atteindre le bloc sur la pince, et après 30 s, relâchez lentement le gabarit et confirmez la blessure par la structure altérée du nerf (Figure 1B).
      REMARQUE : Les altérations structurelles du nerf confirment le degré de gravité de la blessure. Cela peut être vérifié à l’aide de la microscopie dans les cas d’essai.
   4. Après le SNCI, enterrez soigneusement le nerf entre les muscles pour éviter les lésions iatrogènes par un chirurgien.
      REMARQUE : Les blessures par écrasement causées par des pinces calibrées étaient exactes, fiables et reproductibles, ce qui a été établi à l’aide du capteur de pression de pincement^{de précision 31} (figure 1D). L’évolution temporelle de la pression de blessure par écrasement en temps réel par différents gabarits avec des pinces est illustrée aux figures 2A, B.
5. Effectuez la section et la colle (TG).
   1. Transecter complètement le SN à ~3 mm proximal de la trifurcation SN à l’aide de ciseaux de dissection.
   2. Après la transection, réparez instantanément l’espace nerveux en appliquant 10 μL de colle de fibrine (voir le tableau des matériaux) autour du site de transsection pour limiter le déplacement supplémentaire des extrémités nerveuses sectionnées. Le temps de coagulation de la colle de fibrine était de ~15 s.
      REMARQUE : L’écart SN était incontrôlé et aléatoire après la section en raison de la rétraction, ce qui pourrait être une variable pour le résultat résultant.
6. Effectuez une section et de la colle par étapes (STG).
   1. Transecter le SN de manière incomplète (80 % de sa largeur) ~3 mm à proximité de la trifurcation du SN à l’aide de ciseaux de dissection empêchant la formation d’espaces.
   2. Ensuite, appliquez 10 μL de colle de fibrine autour du site de coupe et transectez complètement les 20 % restants du nerf avant la coagulation complète (~10 s) de la colle.
      REMARQUE : Cette méthode a effectivement diminué la formation d’un espace causée par la rétraction élastique des extrémités nerveuses coupées, mais elle était également exempte de manipulation chirurgicale supplémentaire du nerf, contrairement au modèle TG (Figure 3A).
7. Effectuez le retournement et la section avec de la colle (FTG).
   1. Tout d’abord, transectez le SN à 40 % de sa largeur de chaque côté (Figure 3B).
   2. Retournez transversalement le moignon distal et appliquez 10 μL de colle de fibrine autour du site de transsection.
   3. Ensuite, transectez complètement le nerf central à 20 % avant la coagulation complète (~10 s) de la colle de fibrine.
   4. Confirmez la section complète au microscope direct.
8. Effectuez l’espace et la greffe du nerf en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Dans un modèle d’espace nerveux gradué et de greffe, utilisez des paires de souris en série pour la greffe de nerf syngénique en cascade³² en 1 ensemble d’expériences.
   2. Chez une souris (disons la souris #1), créez un espace nerveux de 7 mm (G-7/0) sur le SN droit, où le nerf a été disséqué à ~3 mm proximal de la trifurcation SN et à 7 mm de celle-ci à l’aide d’une échelle graduée stérile (Figure 3C).
      REMARQUE : Un espace nerveux irréparable a été créé en disséquant un nerf sciatique de 7 mm sans greffe. Cette souris est étiquetée G-7/0 car une greffe de 7 mm est prélevée, mais aucune réparation n’est effectuée.
   3. Après la dissection, transférez immédiatement le nerf transecté à l’état stérile de la boîte de Pétri contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et enterrez le moignon proximal du SN (souris #1) sous le muscle avec 10 μL de colle de fibrine.
   4. Ensuite, chez la souris #2, créez un espace nerveux de 5 mm sur le SN droit et greffez la section nerveuse disséquée de 7 mm de la souris #1 à l’aide de colle de fibrine (10 μL, ~10 s) aux deux extrémités (G-5/7) (Figure 3C).
      REMARQUE : Lors de la greffe, des précautions particulières doivent être prises pour éviter les désalignements et autres lésions iatrogènes du SN par le chirurgien.
9. Effectuer une section et des sutures par étapes (STS).
   1. Séduire le nerf sciatique sur 80 % de sa largeur (Figure 3D) et réparer les moignons à l’aide de points de suture épineuraux de nylon 9-0.
   2. Une fois terminé, séduire la partie restante du nerf et réparer à l’aide d’un seul point de nylon 9-0.
   3. Inversez le nerf pour exposer l’arrière de la lacération et utilisez deux points de nylon 9-0 pour terminer la réparation.

Le capteur de pression numérique sur mesure (Figure 1D) fonctionne en détectant la variation de résistance du FSR lorsqu’une force est appliquée. Cet appareil détecte et enregistre les quantités de pression les plus modestes qui lui sont appliquées avec un temps de réponse de <5 μs, une fréquence d’échantillonnage de 20 Hz et une plage de pression de 2,5 à 25 lb³¹. Les différences de pression SNCI induite par les pinc...

L’histoire de la recherche sur le TPNI s’étend sur plusieurs décennies^11,12. Les premières expériences avec des chiens et des espèces plus grandes ont établi l’importance des modèles animaux dans l’étude des résultats de la TPNI 36,37,38. Au fil du temps, ces modèles se sont déplacés vers des rongeurs plus petits, ave...

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (K08 AR060164-01A) et du DOD (W81XWH-16-1-0725 ; W81XWH-19-1-0773) en plus du soutien institutionnel de la Pennsylvania State University College of Medicine, Hershey, PA 17033, États-Unis.