Traumatische periphere Nervenverletzung bei Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt traumatische periphere Nervenverletzungen (TPNIs), einschließlich genau kalibrierter Quetschungen, streng ausgerichteter und falsch ausgerichteter Schnittwunden sowie transplantierter und nicht transplantierter Lücken des Ischiasnervs bei Mäusen. Es werden kundenspezifische Sensoren entwickelt, um Nerventraumata zu messen, die mit allgemein verfügbaren Werkzeugen induziert werden, um reproduzierbare Ergebnisse nach TPNI zu gewährleisten.

Die traumatische periphere Nervenschädigung (TPNI) ist eine häufige Ursache für Morbidität nach einem orthopädischen Trauma. Reproduzierbare und präzise Methoden zur Verletzung von Nerven und zur Entnervung von Muskeln sind seit langem ein Ziel in der muskuloskelettalen Forschung. Viele traumatisch verletzte Gliedmaßen haben ein Nerventrauma, das das langfristige Patientenergebnis bestimmt. Über mehrere Jahre hinweg wurden präzise Methoden zur Herstellung mikrochirurgischer Nervenverletzungen entwickelt, darunter Quetschungen, Schnittwunden und Nervenspalttransplantationen, die eine reproduzierbare Ergebnisbewertung ermöglichen. Darüber hinaus wurden neuere Methoden für kalibrierte Quetschverletzungen entwickelt, die klinisch relevante Korrelationen mit Ergebnissen bieten, die zur Beurteilung menschlicher Patienten verwendet werden. Das Prinzip der minimalen Manipulation, um eine geringe Variabilität der Nervenverletzungen zu gewährleisten, ermöglicht es, noch mehr assoziierte Gewebeverletzungen in diese Modelle aufzunehmen. Dazu gehören direkte Muskelquetschungen und andere Komponenten von Verletzungen der Gliedmaßen. Schließlich machen die Beurteilung der Atrophie und die genaue Analyse der Verhaltensergebnisse diese Methoden zu einem Komplettpaket für die Untersuchung von Muskel-Skelett-Traumata, das alle Elemente der traumatischen Verletzungen der menschlichen Gliedmaßen realistisch berücksichtigt.

Die traumatische periphere Nervenschädigung (TPNI) ist eine häufige Ursache für Morbidität nach orthopädischen Traumata ^1,2,3. Jährlich erleiden etwa 3 % der Traumapatienten Nervenverletzungen ^1,4, bei einer Inzidenz von 3.50.000 Fällen⁵, was zu 50.000 chirurgischen Reparaturen^{führt 6}. TPNIs treten in einem breiten Schweregrad auf, und die funktionelle Erholung hängt direkt von der Art und Schwere dieser Verletzungen ab ^7,8,9. Ein weniger schweres Trauma (z. B. leichter Druck, unvollständige Platzwunde usw.) verletzt zuerst die Myelinscheide und die Axone, während schwerere Kräfte (z. B. starker Druck, vollständige Platzwunden usw.) das Bindenervengewebe stören; Zum Beispiel das Endoneurium, das Perineurium und das Epineurium zusätzlich zum Myelin und den Axonen ^1,10. Patienten mit TPNI hoffen, dass die Nervenfunktion irgendwann zurückkehrt und die Muskelatrophie rückgängig gemacht wird. Jahrzehntelange Forschung hat trotz Fortschritten bei den Behandlungsverfahren keine präzisen Behandlungen zur Verbesserung oder Sicherstellung einer vollständigen Genesung geliefert^11,12.

Nervendurchtrennungen heilen nicht ohne chirurgische Reparatur, die oft unter dem Mikroskop durchgeführt wird. Reparaturen werden in der Regel durchgängig durchgeführt, wobei darauf geachtet wird, dass die Reparaturstelle nicht unter Spannung steht. Die Nerventransplantation wird verwendet, um sicherzustellen, dass die Reparaturen spannungsfrei sind^13,14. Trotz der scheinbar fortschrittlichen Methoden, die bei diesen Reparaturen verwendet werden, ist die Funktionswiederherstellung im Allgemeinen unbeeindruckend^11,12. Die Rehabilitation ist oft unvollständig und unbefriedigend. Die optimale funktionelle Wiederherstellung erfordert regenerierende Axone, die die Verletzungsstelle (Nervenbrücke) überqueren und das Zielorgan innervieren. Diese Prozesse werden durch axonale Fehlleitung oder Wachstumsverzögerung erschwert, was zu Muskelatrophie und schließlich zum Versagen der Erholung führt 15,16,17,18. Es wurde gezeigt, dass die funktionellen Ergebnisse nach einer Nervenreparatur (z. B. End-to-End-Naht, Isotransplantation usw.) von der Genauigkeit der Faszikularabapposition abhängen^19,20. Die richtige Richtungsabhängigkeit der durchtrennten Nervenstümpfe und ihrer Faszikel ist daher entscheidend für die Nervenreparatur, ohne die auch bei optimaler axonaler Regeneration eine schlechte funktionelle Wiederherstellung zu erwarten ist. Die mikrochirurgische Nahtreparatur selbst ist ein traumatischer Prozess, und es hat sich wenig getan, was neue Methoden zur drastischen Verbesserung der Ergebnisse betrifft. In diesem Feld fehlen reproduzierbare Tiermodelle für die Nervendurchtrennung, was zu vorhersehbaren Lücken führt, die zuverlässige Erholungsmessungen auf funktioneller und Gewebeebene ermöglichen. Solche Methoden, falls verfügbar, würden eine Charakterisierung der Nervenregeneration ermöglichen, ohne die Probleme variabler Veränderungen in der neuralen Vaskularisation und der Post-Denervationsatrophie^21,22. Viele Gruppen bemühen sich, bessere Modelle zu verwenden, die diese Art von Variabilität begrenzen. Eine Möglichkeit besteht darin, sicherzustellen, dass Nervenreparaturen minimal manipuliert werden und Nervenstümpfe perfekt entgegengesetzt werden.

Dies wird am besten durch die Verwendung einer standardisierten peripheren Nervendurchtrennungstechnik erreicht, die als schrittweiser Schnitt und Fibrinkleber (STG) bezeichnet wird. Reparaturen werden bei diesem STG-Modell mit Fibrinkleber gesichert, die Spaltabstände sind standardisiert und minimiert^21,22. Fibrinkleber selbst wird beim Menschen für diese Reparaturen eingesetzt, wahrscheinlich aus den gleichen Gründen, zusammen mit seinen positiven Auswirkungen auf die Narbenbildung nach der Reparatur^23,24. Der Schlüssel zu der vorliegenden Methode besteht darin, dass die Nervenreparatur beginnt, bevor die Platzwunde abgeschlossen ist, wodurch ein festes Verletzungsmuster gewährleistet wird. Diese derzeitige Methode wies eine enge Gemeinsamkeit mit der charakteristischen Pathophysiologie der Nervendurchtrennung mit der epineuralen Goldstandardnaht auf, und der negative Einfluss von Fibrinkleber auf die Nervenregeneration wurde nicht beobachtet. Die Reparatur der Ischiasnervendurchtrennung mit Fibrinkleber bei Mäusen verbessert die Verlängerungung des Axons im Vergleich zur frühen Nervenregeneration durch Nähen, und diese Befunde stimmen mit der STG überein. Die STG profitiert auch vom Prinzip der minimalen Manipulation, bei dem der Nerv für die Nahtpositionierung nie berührt wird²¹. Dadurch wird das mit der Reparatur verbundene Nerventrauma im Modell effektiv standardisiert. Ähnliche Prinzipien wurden verwendet, um die Fehlstellung zu untersuchen, indem der Nerv vor dem Kleben^{umgedreht wurde 22}. Dies ermöglichte einen direkten Vergleich von Nervenverletzungen, bei denen fast die gleiche Menge an Manipulationen zu Unterschieden in der Ausrichtung beitrug, ohne dass der Spalt oder das Trauma vergrößert wurde. Dies ermöglichte die direkte Untersuchung des Einflusses der Ausrichtung auf durch Nervenverletzungen induzierte neurovaskuläre Veränderungen^21,22, Muskelatrophie^21,22 und funktionelle Erholung^21,22. Die vorliegende Untersuchung ist alles, was die Untersuchung von gezielt und präzise falsch ausgerichteten Nervenstümpfen ermöglicht.

Die meisten Nerven bei TPNI sind nicht durchtrennt, haben keine Lücke oder Defekte und scheinen in der Lage zu sein, sich zu erholen, und doch bleiben in vielen dieser Fälle die Gliedmaßen aufgrund von Nervenverletzungen und verwirrenden Eingriffen dauerhaft funktionsunfähig. Experimentelle TPNIs werden üblicherweise bei Ischiasnervenquetschverletzungen (SNCIs) von Nagetieren unter Verwendung von Locking Needle Drivers (NDs), Pinzetten oder ähnlichen Geräten und einem erfahrenen Chirurgen durchgeführt, um eine präzise und reproduzierbare Quetschverletzung zu erzeugen 25,26,27,28,29,30. SNCI-Tiermodelle beruhen auf der angeborenen Bedienerpräzision, um Druckschwankungen zu begrenzen, aber dies wird nie explizit gemessen. Dies führt zu einer Variabilität zwischen Tieren und Studien, ohne dass es eine klare Anleitung zum standardisierten Druck gibt. Es wird daher erwartet, dass die Fähigkeit, eine kohärente, genaue Reihe von Verletzungen mit verschiedenen bekannten Intensitäten präzise zu liefern und zu melden, für das TPNI-Feld von Vorteil sein könnte. Ein perfektes Modell kann jedem Tier von jedem Labor oder Forscher einen SNCI mit dem Schweregrad einer bekannten Nervenverletzung liefern, um eine authentische Inter-Studie und die Reproduzierbarkeit des Geräts zu gewährleisten. Um diesen Mangel zu beheben, wurde ein einzigartiges kalibriertes digitales Gerät konstruiert, das einen Force Sensitive Resistor (FSR) enthält, der in der Lage ist, den auf einen Nerv ausgeübten Druck (in Echtzeit) zu melden. Diese Vorrichtung wurde dann auf die Reproduzierbarkeit verschiedener Quetschverletzungsdrücke getestet, die von verschiedenen Arten von Pinzetten und NDs³¹ ausgeübt wurden.

Schließlich wurde eine spezifische Methode entwickelt, um Lücken im Nerv³² zu schließen. Die Nervenlücken werden in der Literatur induziert, indem ein Nervenabschnitt entfernt und dann wieder in den Defekt repariert wird 13,33,34. Die für diesen chirurgischen Eingriff erforderliche Manipulation wird oft durch das Nähen verstärkt, und die Stümpfe des Nervs ziehen sich variabel^zurück 21,32,34. Es basierte auf der Überlegung, dass bei der Verwendung von isogenen übergroßen Nerventransplantaten die Retraktion des Nervenstumpfes niemals ein Problem darstellen wird³². Die Methode erforderte die gleichzeitige Operation an zwei oder drei Tieren gleichzeitig, wobei ein 7-mm-Transplantat entnommen wurde, um in einen 5-mm-Defekt eingesetzt zu werden, der bei einem anderen Tier induziert wurde. Die Defektgröße des zweiten Tieres wurde dann verwendet, um bei Bedarf einen noch kleineren Defekt in ein anderes Tier zu transplantieren. Daraus entstand eine umfassende Methode zur gleichzeitigen Operation, bei der Defekte mit Spendernerven transplantiert werden, die immer größer als der Nervendefekt sind, um eine spannungsfreie Reparatur zu gewährleisten. In Verbindung mit dem Erfordernis minimaler Manipulation bietet dies eine Möglichkeit, die Transplantatlänge direkt an syngenen Tieren ohne asymmetrische Transplantatlücken zu untersuchen, die in der Literatur allgegenwärtig sind 20,32,34.

Das Versuchsdesign und die Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Penn State University College of Medicine genehmigt. Für die Studien wurden adulte männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 10 Wochen mit einem Gewicht von 20-25 g verwendet. Die Tiere wurden in der Tiereinrichtung unter sterilen Tierhaltungsbedingungen untergebracht und mindestens 5 Tage vor der Durchführung der Studien akklimatisiert.

1. Vorbereitung der Tiere

1. Betäuben Sie die Tiere tief mit einem Cocktail aus Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion mit einer 26-G-Nadel.
2. Rasieren Sie die rechte Hintergliedmaße und den unteren Rücken der Tiere mit einem Trimmer und reinigen Sie sie dann mit Alkohol, der mit 10%iger Povidon-Jod-Lösung zubereitet wurde, und verwenden Sie sterile Applikatoren mit Wattespitze (siehe Materialtabelle).
3. Tragen Sie Augenschmiersalbe mit sterilen Applikatoren mit Wattespitze auf die Augen auf, um Trockenheit der Augen zu vermeiden.
4. Legen Sie die Tiere nach der Zubereitung auf ein homöothermisches Heizkissen (siehe Materialtabelle), um die Körpertemperatur auf 37 °C zu halten.
5. Kleben Sie die Hintergliedmaßen der Mäuse auf das Heizkissen und positionieren Sie sie vorsichtig symmetrisch, so dass das Kniegelenk einen rechten Winkel zum Körper bildet.
6. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren und legen Sie sie dann auf das sterile Pad.
   HINWEIS: Der Chirurg muss eine sterile Maske, einen Kittel und Handschuhe tragen, bevor er Operationen durchführt.

2. Modellerstellung für traumatische periphere Nervenverletzungen (TPNI)

1. Machen Sie nach der Präparation einen seitlichen Hautschnitt (~2 cm) entlang der Länge des Oberschenkelknochens mit einer Schere und einem Präzisions-Stereozoom-Binokularmikroskop (siehe Materialtabelle).
2. Legen Sie den Ischiasnerv (SN) mit einer Präparierschere und einer mikrochirurgischen Pinzette stumpf durch das iliotibiale Band frei. Vermeiden Sie iatrogene mechanische Beschädigungen des SN.
3. Verschließen Sie die Haut nach TPNI-Operationen mit chirurgischen Klammern (Schritte 4-9). Verabreichen Sie allen Tieren subkutan Buprenorphin mit langsamer Freisetzung (0,05 mg/kg) (siehe Materialtabelle) als Analgetikum.
4. Führen Sie eine Ischiasnervenquetschverletzung (SNCI) durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Positionieren Sie das SN etwa 3 mm proximal zur Trifurkation in der flachen Form zwischen den Pinzettenspitzen (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Es ist äußerste Vorsicht geboten, um eine unförmige Position zu vermeiden, die zu Abweichungen in den Versuchsergebnissen zwischen Tieren/Gruppen führt.
   2. Führen Sie die SNCI mit einer kalibrierten Pinzette und kundenspezifischen Aluminiumvorrichtungen durch (Abbildung 1C)^31,35, um einen spezifischen Druck über eine feste Breite (3,5 mm) zu erzielen.
      HINWEIS: Die Einzelheiten des digitalen Drucksensorgeräts für SNCI mit kalibrierten Zangen und kundenspezifischen Bohrvorrichtungen sind in unseren zuvor veröffentlichten Berichten^31,35 aufgeführt. Kundenspezifische Vorrichtungen wurden hergestellt, indem Löcher in kleine Aluminiumstücke gebohrt wurden. Es wurde bestätigt, dass diese Vorrichtungen unter Verwendung eines digitalen Drucksensors spezifische Drücke erzeugen, wobei Teile und Spezifikationen verwendet werden, die öffentlich zugänglich und zuvor beschrieben wurden^31,35.
   3. Nach der Positionierung schieben Sie die Vorrichtung sanft, um den Block auf der Pinzette zu erreichen, und lassen Sie nach 30 s die Vorrichtung langsam los und bestätigen Sie die Verletzung durch die veränderte Struktur des Nervs (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Die strukturellen Veränderungen des Nervs bestätigen den Schweregrad der Verletzung. Dies kann in Gerichtsverfahren mit Hilfe der Mikroskopie überprüft werden.
   4. Vergraben Sie nach der SNCI den Nerv vorsichtig zwischen den Muskeln, um iatrogene Verletzungen durch einen Chirurgen zu vermeiden.
      HINWEIS: Die durch die kalibrierte Pinzette verursachten Quetschverletzungen waren exakt, zuverlässig und reproduzierbar, was mit Hilfe der Präzisions-Quetschdrucksensorvorrichtung³¹ festgestellt wurde (Abbildung 1D). Der Zeitverlauf des Echtzeit-Quetschungsdrucks durch verschiedene Vorrichtungen mit Pinzetten ist in Abbildung 2A,B dargestellt.
5. Führen Sie Transsektion und Kleben (TG) durch.
   1. Transschneiden Sie das SN vollständig ~3 mm proximal zur SN-Trifurkation mit einer Präparierschere.
   2. Reparieren Sie den Nervenspalt nach der Durchtrennung sofort, indem Sie 10 μl Fibrinkleber (siehe Materialtabelle) um die Durchtrennungsstelle herum auftragen, um eine weitere Verschiebung der durchtrennten Nervenenden zu begrenzen. Die Gerinnungszeit von Fibrinkleber betrug ~15 s.
      HINWEIS: Die SN-Lücke war nach der Durchtrennung aufgrund der Retraktion unkontrolliert und willkürlich, was eine Variable für das resultierende Ergebnis sein könnte.
6. Führen Sie schrittweise Durchtrennung und Kleben (STG) durch.
   1. Transschneiden Sie das SN unvollständig (80% seiner Breite) ~3 mm proximal der SN-Trifurkation mit einer Präparierschere, um die Bildung von Lücken zu verhindern.
   2. Tragen Sie anschließend 10 μl Fibrinkleber um die Schnittstelle auf und durchschneiden Sie die restlichen 20% des Nervs vollständig, bevor der Kleber vollständig gerinnt (~10 s).
      HINWEIS: Diese Methode verringerte effektiv die Lückenbildung, die durch die elastische Retraktion der durchtrennten Nervenenden verursacht wurde, war aber im Gegensatz zum TG-Modell auch frei von zusätzlichen chirurgischen Eingriffen am Nerv (Abbildung 3A).
7. Führen Sie Flip and Transection with Glue (FTG) durch.
   1. Zuerst wird das SN von jeder Seite auf 40 % seiner Breite durchtrennt (Abbildung 3B).
   2. Drehen Sie den distalen Stumpf quer um und tragen Sie 10 μl Fibrinkleber um die Durchtrennungsstelle auf.
   3. Als nächstes durchschneiden Sie den zentralen 20%-Nerv vollständig, bevor Sie die Gerinnung (~10 s) des Fibrinklebers abschließen.
   4. Bestätigen Sie die vollständige Durchtrennung unter einem direkten Mikroskop.
8. Führen Sie eine Lücke und Transplantation des Nervs durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Verwenden Sie in einem abgestuften Nervenlücken- und Transplantationsmodell Mauspaare in Reihe für die Kaskaden-syngene Nerventransplantation³² in 1 Versuchsreihe.
   2. Erzeugen Sie bei einer Maus (z. B. Maus #1) eine 7 mm (G-7/0) Nervenlücke auf dem rechten SN, wo der Nerv ~3 mm proximal zur SN-Trifurkation und 7 mm Abstand davon mit einer sterilen Skala präpariert wurde (Abbildung 3C).
      HINWEIS: Eine irreparable Nervenlücke wurde durch Präparation eines 7 mm großen Ischiasnervs ohne Transplantation geschaffen. Diese Maus ist mit G-7/0 gekennzeichnet, da ein 7-mm-Transplantat entnommen, aber keine Reparatur durchgeführt wird.
   3. Nach der Dissektion wird der durchtrennte Nerv sofort in den sterilen Zustand der Petrischale mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) überführt und der proximale Stumpf des SN (Maus #1) mit 10 μl Fibrinkleber unter dem Muskel vergraben.
   4. Als nächstes erzeugen Sie in Maus #2 eine 5 mm große Nervenlücke auf dem rechten SN und transplantieren den 7 mm präparierten Nervenabschnitt von Maus #1 mit Fibrinkleber (10 μL, ~10 s) an beiden Enden (G-5/7) (Abbildung 3C).
      HINWEIS: Bei der Transplantation muss besondere Sorgfalt walten lassen, um Fehlstellungen und andere iatrogene Verletzungen des SN durch den Chirurgen zu vermeiden.
9. Führen Sie schrittweise Durchtrennungen und Nähte (STS) durch.
   1. Verstärken Sie den Ischiasnerv auf 80 % seiner Breite (Abbildung 3D) und reparieren Sie die Stümpfe mit epineuralen Nähten aus 9-0 Nylon.
   2. Nach Abschluss des Nervs wird der verbleibende Teil des Nervs gestärkt und mit einem einzigen 9-0-Nylonstich repariert.
   3. Drehen Sie den Nerv um, um die Rückseite der Platzwunde freizulegen, und verwenden Sie zwei 9-0 Nylonstiche, um die Reparatur abzuschließen.

Der speziell angefertigte digitale Drucksensor (Abbildung 1D) erkennt die Widerstandsänderung des FSR, wenn eine Kraft ausgeübt wird. Dieses Gerät erfasst und zeichnet die geringsten Druckmengen auf, die mit einer Ansprechzeit von <5 μs, einer Abtastrate von 20 Hz und einem Druckbereich von 2,5 bis 25 lbs³¹ ausgeübt werden. Die Unterschiede im durch die Zange (Abbildung 1C) induzierten SNCI-Druck (

Die Geschichte der TPNI-Forschung erstreckt sich über mehrere Jahrzehnte^11,12. Frühe Experimente mit Hunden und größeren Arten zeigten die Bedeutung von Tiermodellen bei der Untersuchung der TPNI-Ergebnisse 36,37,38. Im Laufe der Zeit haben sich diese Modelle auf kleinere Nagetiere ausgeweitet, wobei ihre etablierten und häufig verw...

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des NIH (K08 AR060164-01A) und des DOD (W81XWH-16-1-0725; W81XWH-19-1-0773) sowie institutioneller Unterstützung durch das Pennsylvania State University College of Medicine, Hershey, PA 17033, USA.