Травматическое повреждение периферических нервов у мышей

В настоящем протоколе описаны травматические повреждения периферических нервов (TPNI), включая точно откалиброванное раздавливание, строго выровненные и смещенные разрывы, а также пересаженные и непересаженные разрывы седалищного нерва у мышей. Специально разработанные датчики разрабатываются для измерения травмы нерва, вызванной общедоступными инструментами, чтобы обеспечить воспроизводимые результаты после TPNI.

Травматическое повреждение периферических нервов (ТПН) является частой причиной заболеваемости после ортопедической травмы. Воспроизводимые и точные методы повреждения нервов и денервирующих мышц уже давно являются целью исследований опорно-двигательного аппарата. Многие травматически поврежденные конечности имеют травму нерва, которая определяет долгосрочный исход для пациента. В течение нескольких лет были разработаны точные методы получения микрохирургических повреждений нервов, включая раздавливание, рваные раны и трансплантацию нервной щели, что позволяет проводить воспроизводимую оценку исходов. Кроме того, создаются новые методы для калиброванных травм от раздавливания, которые предлагают клинически значимую корреляцию с исходами, используемыми для оценки состояния пациентов. Принципы минимальных манипуляций для обеспечения низкой вариабельности повреждения нервов позволяют добавить в эти модели еще больше ассоциированных повреждений тканей. Это включает в себя прямое раздавливание мышц и другие компоненты травмы конечностей. Наконец, оценка атрофии и точный анализ поведенческих исходов делают эти методы полным пакетом для изучения травмы опорно-двигательного аппарата, который реалистично включает в себя все элементы травматического повреждения конечностей человека.

Травматическое повреждение периферических нервов (ТПН) является частой причиной заболеваемости после ортопедической травмы ^1,2,3. Ежегодно примерно 3% пациентов с травмами получают повреждения нервов ^1,4, в 3 50 000 случаев⁵, что приводит к 50 000 хирургических операций⁶. ППНИ протекают в широком диапазоне степени тяжести, и функциональное восстановление напрямую зависит от типа и тяжести этих травм ^7,8,9. Менее тяжелая травма (например, легкое раздавливание, неполная рваная рана и т. д.) сначала повреждает миелиновую оболочку и аксоны, в то время как более серьезные силы (например, сильное раздавливание, полные рваные раны и т. д.) нарушают соединительные нервные ткани; Например, эндоневрий, периневриум и эпиневрий в дополнение к миелину и аксонам ^1,10. Пациенты с TPNI надеются, что функция нервов в конечном итоге восстановится, и мышечная атрофия будет обращена вспять. Десятилетия исследований не предоставили точных методов лечения, которые могли бы улучшить или обеспечить полное выздоровление, несмотря на достижения в процедурах лечения^11,12.

Пересечения нервов не заживут без хирургического вмешательства, которое часто проводится под микроскопом. Ремонт обычно выполняется от начала до конца, при этом прилагаются усилия, чтобы убедиться, что место ремонта не находится под напряжением. Пересадка нерва используется для обеспечения того, чтобы операции были без натяжения^13,14. Несмотря на кажущиеся передовыми методы, используемые при этих ремонтах, функциональное восстановление, как правило, не впечатляет^11,12. Реабилитация часто бывает неполной и неудовлетворительной. Оптимальное функциональное восстановление требует, чтобы регенерирующие аксоны пересекали место повреждения (нервный мост) и иннервировали целевой орган. Эти процессы осложняются неправильным направлением аксонов или задержкой роста, что приводит к атрофии мышц и возможной неспособности к восстановлению 15,16,17,18. Было показано, что функциональные исходы после восстановления нерва (например, наложение швов конец в конец, изотрансплантат и т.д.) зависят от точности фасцикулярной аппозиции^19,20. Таким образом, правильная направленность пересеченных нервных культей и их пучков имеет решающее значение для восстановления нервов, без чего можно ожидать плохого функционального восстановления даже при оптимальной регенерации аксонов. Микрохирургическое наложение швов само по себе является травматичным процессом, и мало что произошло с точки зрения новых методов для радикального улучшения результатов. В этой области отсутствуют воспроизводимые животные модели пересечения нервов, что приводит к предсказуемым разрывам, позволяющим проводить надежные измерения восстановления на функциональном и тканевом уровне. Такие методы, если они будут доступны, позволят охарактеризовать регенерацию нервов без проблем вариабельных изменений в нервной васкуляризации и постденервационной атрофии^21,22. Многие группы пытаются использовать более совершенные модели, ограничивающие такого рода изменчивость. Один из способов заключается в том, чтобы обеспечить минимальные манипуляции при восстановлении нервов, а нервные культи были идеально противопоставлены.

Лучше всего это достигается с помощью стандартизированной техники пересечения периферических нервов, называемой ступенчатой резкой и фибриновым клеем (STG). Ремонт в этой модели STG закреплен фибриновым клеем, а расстояния между зазорами стандартизированы и сведены к минимуму^21,22. Фибриновый клей сам по себе используется у людей для этих ремонтов, вероятно, по тем же причинам, наряду с его благотворным воздействием на образование рубцов после восстановления^23,24. Ключом к настоящему методу является то, что восстановление нерва начинается до того, как рваная рана будет завершена, что обеспечивает фиксированный характер травмы. Данный метод продемонстрировал близкую общность с характерной патофизиологией пересечения нерва с золотым стандартом эпиневрального шва, при этом негативного влияния фибринового клея на регенерацию нервов не наблюдалось. Восстановление пересечения седалищного нерва с помощью фибринового клея у мышей улучшает удлинение аксона по сравнению с ранней регенерацией нерва путем наложения швов, и эти результаты согласуются с STG. STG также выигрывает от принципа минимальной манипуляции, при котором нерв никогда не трогают для наложения шва²¹. Это эффективно стандартизирует травму нерва, связанную с восстановлением в модели. Аналогичные принципы были использованы для исследования смещения путем переворачивания нерва перед склеиванием²². Это позволило провести прямое сравнение повреждений нервов, в которых почти одинаковое количество манипуляций способствовало различиям в выравнивании без увеличения разрыва или травмы. Это облегчило непосредственное изучение влияния выравнивания на нейроваскулярные изменения, вызванные повреждением нервов^21,22, мышечную атрофию^21,22 и функциональное восстановление^21,22. Настоящее исследование – это все, что позволяет целенаправленно и точно изучать смещенные нервные культи.

Большинство нервов в TPNI не разорваны, не имеют разрыва или дефекта и, по-видимому, способны к восстановлению, и все же во многих из этих случаев конечности остаются навсегда дисфункциональными из-за травм нервов и смешанных вмешательств. Экспериментальные TPNI обычно выполняются при травмах раздавливания седалищного нерва у грызунов с использованием блокирующих игольчатых приводов (NDs), щипцов или аналогичных устройств, а также опытного хирурга для создания точной и воспроизводимой травмы от раздавливания 25,26,27,28,29,30 . Животные модели SNCI зависят от врожденной точности оператора для ограничения колебаний давления, но она никогда не измеряется явно. Это приводит к вариабельности между животными и исследованиями, при этом нет четких указаний по стандартизированному давлению. Таким образом, ожидается, что возможность точного отображения и отчетности о последовательной, точной серии травм с различной известной интенсивностью может принести пользу в области TPNI. Идеальная модель может предоставить SNCI известной степени повреждения нерва каждому животному любой лабораторией или исследователем для достоверного взаимного исследования и воспроизводимости устройства. Чтобы восполнить этот недостаток, было сконструировано уникальное откалиброванное цифровое устройство, содержащее чувствительный к силе резистор (FSR), способный сообщать о давлении (в режиме реального времени), приложенном к нерву. Затем это устройство было протестировано на воспроизводимость различных давлений раздавливания при раздавливании, создаваемых различными типами щипцов и NDs³¹.

Наконец, был разработан специальный метод для устранения пробелов в нерве³². Нервные промежутки в литературе индуцируются путем удаления участка нерва и последующего его восстановления в дефекте 13,33,34. Манипуляция, необходимая для этой хирургической процедуры, часто осложняется наложением швов, и культи нерва втягиваются по-разному 21,32,34. Он был основан на рассуждении, что при использовании изогенных нервных трансплантатов большого размера, ретракция культи нерва никогда не^{будет проблемой.} Метод требовал одновременной операции на двух или трех животных одновременно, при этом трансплантат диаметром 7 мм помещался в дефект диаметром 5 мм, вызванный у другого животного. Размер дефекта второго животного затем использовался для пересадки еще меньшего дефекта другому животному, если это было необходимо. Это привело к созданию комплексного метода одновременной хирургии для пересадки дефектов с донорскими нервами, которые всегда больше дефекта нерва, чтобы обеспечить восстановление без напряжения. В сочетании с требованием минимальных манипуляций, это открывает возможности для изучения длины трансплантата непосредственно у сингенных животных без асимметричных разрывов между трансплантатами, которые повсеместно встречаются в литературе 20,32,34.

Дизайн эксперимента и протоколы на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинском колледже Университета штата Пенсильвания. Для исследований использовали взрослых самцов мышей C57BL/6J в возрасте 10 недель и массой тела 20-25 г. Животные содержались в помещении для животных в стерильных условиях содержания и акклиматизировались не менее чем за 5 дней до проведения исследований.

1. Подготовка животных

1. Глубоко обезболите животных с помощью коктейля из кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) путем внутрибрюшинной инъекции с помощью иглы 26 G.
2. Выбрейте правую заднюю конечность и нижнюю часть спины животного с помощью триммера, а затем очистите спиртом, приготовленным с 10% раствором повидон-йода, с помощью стерильных аппликаторов с ватными наконечниками (см. Таблицу материалов).
3. Нанесите на глаза офтальмологическую мазь-смазку с помощью стерильных аппликаторов с ватным наконечником, чтобы избежать сухости глаз.
4. После подготовки поместите животных на гомеотермическую грелку (см. Таблицу материалов), чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37 °C.
5. Прикрепите задние конечности мышей к грелке и аккуратно расположите их симметрично так, чтобы коленный сустав находился под прямым углом к телу.
6. Простерилизуйте все хирургические инструменты путем автоклавирования, а затем поместите их на стерильную прокладку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением операции хирург должен надеть стерильную маску, халат и перчатки.

2. Создание модели травматического повреждения периферических нервов (TPNI)

1. После подготовки сделайте боковой разрез кожи (~2 см) по длине бедренной кости с помощью ножниц и прецизионного бинокулярного микроскопа со стереозумом (см. Таблицу материалов).
2. Тупо обнажите седалищный нерв (СН) через подвздошно-большеберцовую ленту с помощью рассекающих ножниц и микрохирургических щипцов. Избегайте любых ятрогенных механических повреждений СН.
3. Закройте кожу хирургическими скобами после операций TPNI (шаги 4-9). Вводите бупренорфин с медленным высвобождением (0,05 мг/кг) (см. Таблицу материалов) подкожно всем животным в качестве анальгетика.
4. Выполните лечение травмы сдавливания седалищного нерва (SNCI), выполнив следующие действия.
   1. Расположите SN примерно на 3 мм проксимальнее трифуркации в плоской форме между кончиками щипцов (Рисунок 1A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо проявлять крайнюю осторожность, чтобы избежать деформации положения, которая приводит к различиям в экспериментальных результатах между животными/группами.
   2. Выполните SNCI с использованием калиброванных щипцов и специальных алюминиевых зажимов (Рисунок 1C)^31,35, чтобы получить определенное давление на фиксированной ширине (3,5 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о цифровом датчике давления для SNCI с использованием калиброванных щипцов и специальных расточных приспособлений упоминается в наших ранее опубликованных отчетах^31,35. Кастомные приспособления изготавливались путем сверления отверстий в небольших кусочках алюминия. Подтверждено, что эти приспособления создают определенное давление с помощью цифрового датчика давления, используя детали и спецификации, находящиеся в открытом доступе и описанные ранее^31,35.
   3. После позиционирования осторожно надавите на приспособление, чтобы добраться до блока на щипцах, а через 30 с медленно отпустите приспособление и подтвердите повреждение измененной структурой нерва (рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Структурные изменения нерва подтверждают степень тяжести травмы. Это можно проверить с помощью микроскопии в судебных делах.
   4. После SNCI осторожно закопайте нерв между мышцами, чтобы избежать ятрогенного повреждения хирургом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Травмы от раздавливания, вызванные калиброванными щипцами, были точными, надежными и воспроизводимыми, что было установлено с помощью прецизионного датчика давления³¹ (рисунок 1D). Временной ход давления раздавливания в реальном времени различными зажимными приспособлениями с щипцами изображен на рисунках 2A, B.
5. Выполните пересечение и склеивание (ТГ).
   1. Полностью пересеките SN на ~3 мм проксимальнее трифуркации SN с помощью препарирующих ножниц.
   2. После пересечения немедленно восстановите нервную щель, нанеся 10 мкл фибринового клея (см. Таблицу материалов) вокруг места пересечения, чтобы ограничить дальнейшее смещение отрезанных нервных окончаний. Время свертывания фибринового клея составляло ~15 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрыв SN был неконтролируемым и беспорядочным после пересечения из-за ретракции, которая может быть переменной для результирующего результата.
6. Выполните ступенчатое рассечение и склеивание (СТГ).
   1. Рассекайте SN не полностью (80% его ширины) ~3 мм проксимальнее трифуркации SN с помощью рассекающих ножниц, предотвращая образование зазоров.
   2. Далее нанесите 10 мкл фибринового клея вокруг места разреза и полностью пересеките оставшиеся 20% нерва до полного свертывания (~10 с) клея.
      Примечание: Этот метод эффективно уменьшал образование разрыва, вызванного эластичной ретрцией перерезанных нервных окончаний, но он также был свободен от дополнительных хирургических манипуляций с нервом, в отличие от модели TG (Рисунок 3A).
7. Выполните переворот и пересечение с помощью клея (FTG).
   1. Сначала пересеките SN на 40% его ширины с каждой стороны (рис. 3B).
   2. Поперечно переверните дистальный отдел культи и нанесите 10 мкл фибринового клея вокруг места пересечения.
   3. Далее полностью пересеките центральный 20% нерв до полного свертывания (~10 с) фибринового клея.
   4. Подтвердите полное пересечение под прямым микроскопом.
8. Выполните разрыв и пересадку нерва, следуя следующим шагам.
   1. В модели дифференцированной нервной щели и трансплантации используйте пары мышей последовательно для каскадной сингенной трансплантации нервов³² в 1 серии экспериментов.
   2. У мыши (скажем, мыши #1) создайте нервную щель шириной 7 мм (G-7/0) на правой SN, где нерв был рассечен на ~3 мм проксимальнее трифуркации SN и на расстоянии 7 мм от нее с помощью стерильной градуированной шкалы (рис. 3C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Непоправимая нервная щель была создана путем рассечения седалищного нерва диаметром 7 мм без трансплантации. Эта мышь имеет маркировку G-7/0, потому что используется 7-миллиметровый трансплантат, но ремонт не выполняется.
   3. После вскрытия немедленно переведите пересеченный нерв в стерильное состояние чашки Петри, содержащей фосфатно-солевой буфер (PBS) и закопайте проксимальную культю SN (мышь #1) под мышцу с 10 μл фибринового клея.
   4. Затем у мыши #2 создайте 5-миллиметровую нервную щель на правой SN и пересадите 7-миллиметровый рассеченный участок нерва от мыши #1 с помощью фибринового клея (10 μL, ~10 s) с обоих концов (G-5/7) (Рисунок 3C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время трансплантации необходимо соблюдать особую осторожность, чтобы избежать смещения и других ятрогенных повреждений SN хирургом.
9. Выполните ступенчатую транссекцию и наложение швов (СТС).
   1. Усильте седалищный нерв на 80% его ширины (Рисунок 3D) и восстановите культи с помощью эпиневральных швов из нейлона 9-0.
   2. После завершения восстановите оставшуюся часть нерва и восстановите с помощью одного нейлонового шва 9-0.
   3. Переверните нерв, чтобы обнажить заднюю часть рваной раны, и используйте два нейлоновых шва 9-0, чтобы завершить ремонт.

Изготовленный на заказ цифровой датчик давления (рис. 1D) работает путем обнаружения изменения сопротивления FSR при приложении силы. Это устройство измеряет и записывает самые скромные величины приложенного к нему давления со временем отклика <5 μс, час...

История исследований TPNI растягивается на несколько десятилетий^11,12. Ранние эксперименты с собаками и более крупными видами показали важность животных моделей в изучении результатов TPNI 36,37,38.

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была поддержана грантами от NIH (K08 AR060164-01A) и DOD (W81XWH-16-1-0725; W81XWH-19-1-0773) в дополнение к институциональной поддержке со стороны Медицинского колледжа Университета штата Пенсильвания, Херши, Пенсильвания 17033, США.