Erişkin Kemirgenlerden Hipokampusun Dorsal Kutbundan Akut Beyin Dilimlerinin Hazırlanması

Bu protokolün amacı, elektrofizyolojik inceleme için dorsal hipokampus dilimleri üretmek için bir yöntemi tanımlamaktır. Bu prosedür, sağlıklı ana nöronların korunmasına izin veren koronal dilimleme açısına yakın bir dilimleme açısı ile dilim hazırlamadan önce soğutulmuş ACSF ile perfüzyon kullanır.

Akut kemirgen beyin dilimlerinden alınan tüm hücre yama-kelepçe kayıtları, hücresel ve sinaptik özelliklerin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlayan modern nörofizyolojik araştırmaların temel dayanağıdır. Bununla birlikte, dilim elektrofizyolojisine ek olarak farklı deneysel modlar arasında korelasyonlu analizler yapmak için giderek artan bir ihtiyaç vardır, örneğin: immünohistokimya, moleküler biyoloji, in vivo görüntüleme veya elektrofizyolojik kayıt; beyin işleviyle ilgili her zamankinden daha karmaşık soruları yanıtlamak için. Bununla birlikte, bu çeşitli deneysel yaklaşımlardan anlamlı sonuçlar çıkarmak kolay değildir, çünkü nispeten iyi tanımlanmış beyin yapıları içinde bile, hücresel fonksiyonun yüksek derecede alt bölgesel varyasyonu mevcuttur. Bu, hiçbir yerde, hücresel ve moleküler özelliklere dayalı olarak iyi tanımlanmış dorso-ventral özelliklere sahip olan hipokampusun CA1'inden daha iyi örneklenemez. Bununla birlikte, yayınlanmış birçok çalışma, protein ekspresyon modellerini inceler veya hipokampusun dorsal genişliğinde in vivo aktiviteyi davranışsal olarak ilişkilendirir; ventromedial bölgeden elde edilen bulguları hücresel elektrofizyoloji ile mekanik olarak açıklayabilecektir. Bu, daha olgun hayvanlarda diğer deney modları gerçekleştirildiğinde, genç hayvanlarda birçok akut dilim elektrofizyolojik deneyin gerçekleştirilmesi gerçeğiyle daha da karıştırılmaktadır. Bu sorunları ele almak için, bu yöntem, olgun (>60 günlük kemirgenlerin) yapay beyin omurilik sıvısı ile transkardiyal perfüzyonunu ve ardından CA1 piramidal hücrelerden kayıt yapmak için dorsal hipokampusun septal kutbu dahil olmak üzere modifiye koronal dilimlerin hazırlanmasını içerir. Bu süreç, sağlıklı akut dorsal hipokampus dilimlerinin üretilmesine yol açar ve diğer ölçümlerle eşleşen dilim bazlı hücresel elektrofizyolojik sorgulamaya izin verir.

Hipokampus, nispeten büyük boyutu ve belirgin laminer yapısı nedeniyle memeli beyninde tartışmasız en iyi çalışılmış yapıdır. Hipokampus bir dizi davranışsal süreçte rol oynamıştır: uzamsal navigasyon, bağlamsal bellek ve bölüm oluşumu. Bu, kısmen, in vivo analiz için kemirgenlerde hipokampusun dorsal kısımlarına göreceli erişim kolaylığından kaynaklanmaktadır. Gerçekten de, ana çıkış hücreleri tipik olarak piyal yüzeyden 2 mm'den daha azdır.

Kemirgenlerde, hipokampus, dorsal septumdan ventral neokortekse uzanan telensefalonun istilasından oluşan nispeten büyük bir yapıdır. 2 ana bölgeden oluşur: dentat girus ve cornu ammonis (CA); ikincisi, bağlantı, hücresel anatomi ve genetik özelliklere dayalı olarak dentat girus hilusa (eski adıyla CA4) uzanan iyi tanımlanmış 3 alt bölgeye (CA1-3) ayrılmıştır¹. Bu yapı, sinaptik özellikler ^2,3,4, anatomi⁵, genetik çeşitlilik ^6,7,8 ve davranışsal işlev ^9,10'da büyük farklılıklar olmasına rağmen, hipokampusun dorso-ventral kapsamı boyunca korunur. CA bölgelerinden, CA1 alt alanı büyük ölçüde glutamaterjik CA1 piramidal hücrelerden (CA1 PC'ler) oluşur, bunun için 3 alt tip^{tanımlanmıştır 11} ve nöronların ~%10'unu oluşturan inhibitör internöronlar, ancak tanımlanan 30'dan fazla alt tip ile oldukça çeşitlidir 12,13,14. Bölgesel spesifik farklılıklara ek olarak, normal yaşlanmanın sinaptik iletim^15,16,17, anatomi¹⁸ ve genetik profil¹⁹ üzerinde dramatik etkileri olduğu gösterilmiştir. Hücresel ve sinaptik özelliklerin karmaşıklıklarını kontrollü bir şekilde değerlendirmek için mevcut altın standart yöntem, akut beyin dilimlerinden²⁰ tam hücre yama-kelepçe kayıtlarının kullanılmasıdır.

Hipokampal fonksiyonun anlaşılması, davranışsal görevler, elektrotların veya görüntüleme pencerelerinin implantasyonu veya viral plazmit ekspresyonu için cerrahi veya anatomik olarak erişim kolaylığı nedeniyle büyük ölçüde dorsal manipülasyona dayanmaktadır. Ek olarak birçok çalışmada, bu işlemler gelişim sırasında beyin yapısındaki değişkenliği önlemek için geç juvenil veya yetişkin kemirgenlerle gerçekleştirilmektedir. Buna rağmen, hücresel ve hücre altı elektrofizyolojiyi incelemek için birçok yaklaşım, çoğunlukla hipokampusun enine düzlemindeki ventro-medial kısmından erken ve orta juvenil kemirgenlerde^{gerçekleştirilir} 21,22,23,24,25. Tüm dorso-ventral kapsamın değerlendirildiği durumlarda, enine genişliği ^4,26 korumak için bir doku kıyıcı kullanılır veya deney genç sıçanlarda²⁷ veya farelerde²⁸ gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, beynin diseksiyonundan önce dokunun soğutulmasının, sıçanlarda²⁹ hipokampal yapıyı ve farelerde^30,31 neokortikal nöronları koruduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, olgun sıçanlarda, modifiye edilmiş koronal dilimler tarafından üretildiği gibi, hipokampusun dorsal enine ekseninden beyin dilimlerinin üretimi ile ilgili bir ayrıntı yetersizliği vardır.

Bu protokol, yaşlı sıçanlardan alınan modifiye edilmiş dorsal hipokampus dilimlerindeki tek veya çift nöronlardan tam hücre yama kelepçesi kayıtlarının elde edilebileceği ve ardından post-hoc morfolojik tanımlamanın yapılabileceği bir yaklaşımı tanımlar. Soğutulmuş yapay beyin omurilik sıvısının (ACSF) transkardiyal perfüzyonunu takiben sağlıklı beyin dilimleri elde edilir, bu da CA1 PC'lerden ve lokal internöronlardan elektrofizyolojik özelliklerin ölçümünü kolaylaştırır.

Tüm hayvanlar, İçişleri Bakanlığı ve Kurumsal yönergelere (HO# P135148E) göre üretildi ve bakımı yapıldı. Tüm sıçanlar 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde tutuldu ve yiyecek ve suya ad libitum erişim sağlandı.

1. Soğutulmuş ACSF'nin transkardiyal perfüzyonu

1. Tüm deneylerden önce, ~ 200 mL sakaroz-ACSF (Tablo 1) -20 ° C'de dondurucuya (dilimleme için yarı donana kadar) ve ~ 100-200 mL filtrelenmiş sükroz-ACSF'yi buz üzerine (perfüzyon için), karbojen (% 95 O₂/5% CO₂).
2. Yetişkin bir fareyi ev kafesinden toplayın ve gürültü ve ışık seviyelerine alışması için prosedür odasındaki bir tutma kafesine ~ 30 dakika yerleştirin.
3. Diseksiyon araçlarını (Şekil 1A), perfüzyon alanını ve enjekte edilebilir anestezikleri (100 mg / kg'lık bir nihai konsantrasyon için yaklaşık 1 mL 200 mg / mL sodyum pentobarbital) hazırlayın.
4. İçine küçük bir bez kağıt mendil veya pamuk yünü koyarak uygun bir anestezi odası hazırlayın. Odadaki emici malzemeye 1-2 mL uçucu izofluran anestezik ekleyin.
5. Fareyi sakinleştirmek için bir anestezi odasına yerleştirin. Solunum hızı saniyede ~ 1 sığ nefese düşene kadar solunumu izleyin.
6. Bu noktada, dilimleme sırasında kullanmak üzere buz üzerinde karbojen ile yarı dondurulmuş sakaroz-ACSF'yi köpürtmeye başlayın.
7. Fareyi tartın ve ağırlığını not edin.
8. Hazırlanan sodyum pentobarbitali intraperitoneal boşluğa enjekte ederek sıçanı terminal olarak anestezikleştirin. Sodyum pentobarbital dozu, daha önce alınan ağırlık ve ilacın stok konsantrasyonundan hesaplanan 100 mg / kg olmalıdır. Fareyi bir tutma odasına yerleştirin ve terminal anestezinin başlaması için 0,5-5 dakika bekleyin.
9. Reflekslerin durduğunu onaylayın: künt bir prob (yani yuvarlak forseps) kullanarak hem kornea göz kırpma (göz bebeğine dokunun) hem de arka pençe kıstırma (bacağı kaldırın ve arka pençeyi sıkıştırın) reflekslerini test edin. Refleksler durduğunda, fareyi hipodermik iğneler kullanarak polistiren veya mantar cerrahi tahtasına sabitleyin.
10. Göğüs boşluğunu açın ve kanülü kalbin sol ventrikülünün tabanına yerleştirin. Sağ atriyumu delin ve hemen buz gibi (0-1 °C) sakaroz-ACSF (50 mL / dakikada peristaltik bir pompa kullanarak) ile perfüzyona başlayın.
11. Tam sıvı değişimi ve vücudun soğuması gerçekleştiğinde (<5 dakika), kanülü ve pimleri çıkarın ve ardından bir giyotin kullanarak kafasını çıkarın.
12. Kemik makası ve Rongeur kemik aletleri kullanarak kafatasını dikkatli ve hızlı bir şekilde çıkarın (Şekil 1A,1B).
    1. Kemik makasını kullanarak foramen magnumdan 2 kez iki taraflı kesi yaparak başlayın ve kafatasını Rongeurs ile lambda dikişine çıkarın. Kemik makası ile orta hat sütürü boyunca gözlerin hemen arkasına kadar dikkatlice kesin.
    2. Kafatasından orta hatta dik olarak 2 kez iki taraflı kesik yapın. Rongeurs'u kullanarak kafatasını orta hat boyunca açın. İnce makas veya çengelli bir iğne kullanarak pia mater'i çıkarmak için ekstra özen gösterin.
13. Künt bir spatula kullanarak beyni kafatasından çıkarın, kraniyal ve optik sinirleri yan yana sıkıştırarak kesin. Dilimlemeden önce beyni 1-2 dakika boyunca karbolene, yarı dondurulmuş (0-1 °C) sükroz-ACSF'ye yerleştirin.

2. Dorsal hipokampustan beyin dilimlerinin hazırlanması

1. Perfüze edilmiş beyni yarı donmuş (0-1 °C) sakaroz-ACSF'den çıkarın ve filtre kağıdı ile kaplı bir cam Petri kabına koyun. Beyni ventral yüzeyine yerleştirin.
2. Bir neşter (No. 22 bıçak) kullanarak, beyni sahneye yapıştırmak için düz bir yüzey oluşturmak için beynin arka kısmını ~10°'de dikeyden çıkarın (Şekil 1C).
3. Vibratom aşamasına az miktarda siyanoakrilat yapıştırıcısı sürün. Beynin kesilen yüzeyinin kesit alanından yaklaşık% 50 daha büyük ince bir film yapmak için yapıştırıcıyı yayın.
4. Beyni cam tabaktan bir spatula üzerine kaldırın, dokuyu yönlendirmek için bir boya fırçası kullanarak kesilmiş tarafı aşağı bakacak şekilde kaldırın. Fazla ACSF'yi çıkarmak için beyni bir doku parçasıyla kurulayın ve beyni, kesilmiş yüzeyi tutkalın merkezine kaydırın. Bir Pasteur pipeti kullanarak, yapıştırıcıyı beyin bloğundan uzaklaştırmak için beynin üzerine 1-2 mL buz gibi soğuk sükroz-ACSF ekleyin.
5. Beyni dilimleme odasına yerleştirin ve yarı donmuş sükroz ACSF ile doldurun. Fazla buzu beyin bloğundan uzak tutmak için bir kaşık veya spatula kullanın ve ardından karbojenize edin (Şekil 1D).
6. Vibratomun bıçağını yerine getirin: beynin dorsal yüzeyinden ~ 1 mm ve bregmanın dikey olarak ~ 1 mm önünde. Bıçağın tamamen suya daldırıldığından emin olun ve bir boya fırçası kullanarak kabarcıkları çıkarın.
7. Beyni dilimlemeye başlayın. Dorsal hipokampusa kadar kesmek için, 1-1,5 mm'lik yatay bıçak hareketi ve ~90 Hz'lik karşılıklı salınım hızı ile 0,1-0,2 mm/s'lik bir hız kullanın. Dorsal hipokampusu dilimlerken, hızı 0.05-0.1 mm / s'ye düşürün.
8. Beyin başına dorsal hipokampus dilimleri (nominal olarak 3-4 tam dilim veya 6-8 hemiseke dilim) toplayın. Uzunlamasına ventro-medial hipokampus dilimleri gerekiyorsa, dilimlemeye devam edin. Dorsal hipokampus dilimlendikten sonra, yaklaşık olarak 3^. ventrikülün pozisyonunun ötesinde ekstra doku kesmeye gerek yoktur. Vibratomu durdurun, dilimi bükülmüş bir hipodermik iğne ile ayırın ve dilimleme odasının tabanında toplayın.
   NOT: Dilimler, deneysel gereksinimlere bağlı olarak 250-500 μm kalınlığında olabilir. Dorsal hipokampustan yapılan kayıtlar için, uygun mikroskopi koşullarına izin verirken yerel ağın çoğunu korumak için tipik olarak 400 μm kalınlığında dilimler kullanın.
9. Dilimleri, diseksiyon mikroskobu altında yalnızca hipokampus ve üstteki korteksi içerecek şekilde kesin. Dilimleri, ön yüzeyi yukarı bakacak şekilde önceden ısıtılmış 35 ° C'lik odaya aktarın.
10. Yapılacak deneye göre depolama haznesini belirleyin. Batık kayıt odalarında dilim yüzeyine yakın yüksek kaliteli tam hücre yama kelepçesi veya hücre dışı alan kayıtları elde etmek için, batık odalarda saklayın. Alternatif olarak, salınımlı ağ aktivitesinin kayıtları veya hücre dışı alan kayıtlarının arayüzü için bir sıvı/gaz arayüz odasında saklayın.
11. Daldırılmış saklama koşulları için, dilimlerin saklama odasına giren son dilimden itibaren 30 dakika boyunca 35 ºC'de toparlanmasına izin verin. Bu, metabolik süreçlerin yeniden etkinleştirilmesine ve kesilmiş nöritlerin yeniden kapatılmasına izin verir. 30 dakika sonra saklama haznesini oda sıcaklığına aktarın.

3. Dorsal hipokampal nöronların kaydedilmesi

1. Kılcal camdan kayıt yama pipetleri üretin. Bu protokolde 1,5 mm dış çap, 0,86 mm iç çap borosilikat cam kullanılır, bu da hücre içi çözelti ile doldurulduğunda 3-5 MΩ'luk bir uç direnci sağlar (Tablo 1). Enerjetik bileşenlerin bozulmasını önlemek için hücre içi çözeltileri buz üzerinde soğuk tutun ve kullanmadan önce filtreleyin (şırınga filtresi, gözenek boyutu: 0,2 μm).
2. Karbojenat kaydı ACSF ve bir su banyosunda (35-40 ºC) önceden ısıtın. Karbojene edilmiş ve önceden ısıtılmış ACSF'yi peristaltik bir pompa tarafından desteklenen perfüzyon tüpü aracılığıyla kayıt odasına iletin. Bir dilimi hazneye aktarmadan birkaç dakika önce perfüzyona başlayın.
3. Perfüzyonu durdurun ve bir beyin dilimini ön yüzeyi yukarı bakacak şekilde kayıt odasına aktarın. Dilimi, bir "arp" şekli oluşturmak için tek ipek lifleri eklenmiş bir platin halka ile yerinde tutun. Dilimleri, CA1'in stratum piramidali ilk kayıt pipetinin eksenine dik olarak çalışacak şekilde konumlandırın.
4. Karbojene edilmiş ve önceden ısıtılmış (35-40 ºC) ACSF kaydını (Tablo 1) optimum 6-8 mL∙^min-1 hızında yeniden başlatın.
   NOT: Yüksek akış hızları (6-8 mL∙^min-1), dilimler^32'deki ağ etkinliğini sürdürmek için idealdir. Daha düşük akış hızları (yani, 2-3 mL∙^min-1), görüntüleme deneyleri için veya biyolojik olarak ilgili ağ aktivitesinin gerekli olmadığı yerlerde dilim stabilitesini korumak için kullanılabilir.
5. 40x objektif büyütmeli (CCD kamera ile görselleştirilmiş) kızılötesi diferansiyel çıkarım kontrast (IR-DIC) optiklerini kullanarak dilim kalitesini değerlendirin. Str. piramidalde pürüzsüz ve hafif çukurlu bir yüzeyin altında 20-30 μm derinliklerde çok sayıda oval şekilli, orta derecede kontrastlı CA1 PC görülebiliyorsa, iyi dilim kalitesini varsayalım (Şekil 2A). Düşük kaliteli dilimler, düzgün olmayan bir dilim yüzeyine sahip, çok sayıda yüksek kontrastlı, büzülmüş veya şişmiş hücre içerir.
6. Yayınlanan diğer verilerle karşılaştırmaya izin vermek için yama pipetlerini hücre içi bir çözeltiyle (örneğin, 24 mM'lik bir hücre içi [Cl^-] bazlı) doldurun.
7. Daha önce açıklandığı gibi tüm hücre yama kelepçesi kayıtlarını gerçekleştirin²². Kırılma üzerindeki membran potansiyeli (V_M) -50 mV'den daha fazla depolarize olmuşsa hücreleri analizden çıkarın, seri direnç >30 MΩ'dur; veya seri direnç kayıt boyunca %>20 oranında değişir. Bu kayıt koşulları altında, seri direnç tipik olarak 8 – 25 MΩ aralığındadır ve 1 saate kadar stabildir.
8. Dorsal hipokampustan CA1 içsel uyarılabilirliğini incelemek için, akım kelepçesi konfigürasyonunda aşağıdaki protokollerle tüm hücre kayıtlarıyla içsel fizyolojik özellikleri test edin:
   1. Öngerilim akımı uygulanmamış dinlenme membran potansiyelinden, 30 kez tekrarlanan küçük (-10 pA, 500 ms) akım adımlarını uygulayın.
   2. Öngerilim akımı uygulandığında -70 mV'dan, bir iz ailesinin 3 tekrarı ile 500 ms süreli (-100 ila +400 pA, 25 pA adım) depolarize edici akım adımlarına hiper uygulayın.
   3. 0,1 ila 20 Hz arasında değişken frekansla 100 pA tepeden tepeye genlikli bir sinüzoidal dalga uygulayın. 3 kez tekrarlayın.
   4. Aksiyon potansiyellerini 20, 40, 60, 80, 100 Hz'de sürmek için 5x 2 nA, 2 ms uyaran uygulayın. Frekans başına 10 tarama.
   5. -70 mV'luk bir voltaj kelepçesinden, kayıt için 5 dakikalık spontan uyarıcı postsinaptik akımlar (EPSC) uygulayın.
9. Başarılı bir kaydın ardından histolojik analiz için hücreleri yeniden kapatmak için, yama pipetini yavaşça geri çekerek dıştan dışa yamalar üretin. -5 mV'luk bir test darbesi ile ölçüldüğü gibi deneysel seviyelerden >1 GΩ'a kadar seri dirençte bir artış gözlemlendiğinde, tutma potansiyelini -40 mV'a yükseltin ve pipeti tamamen geri çekin.
10. Deney tasarımının gerekli istatistiksel gücünü karşılamak için aynı dilimde ek kayıtlar gerçekleştirin.
11. Kaydedilmiş nöronları içeren beyin dilimlerini kayıt odasından çıkarın, 24 oyuklu plakaya yerleştirin, ACSF'yi %4 paraformaldehit (0.1 M fosfat tamponunda) ile değiştirin ve gece boyunca bırakın.
12. Ertesi gün, PFA'yı 0.1 M fosfat tamponu ile değiştirin ve histolojik işleme kadar saklayın. Hücreleri daha önce tarif edildiği gibi floresan konjuge streptavidin ile görselleştirin²².

Yukarıda tarif edilen protokol, olgun sıçanlarda dorsal hipokampusun septal kutbundan canlı dilimlerin hazırlanmasına izin verir. Bu protokoldeki önemli bir faktör, dilim hazırlığından önce soğutulmuş sükroz-ACSF'nin perfüzyonudur ve bu da dilim yüzeyine proksimalde sağlıklı CA1 PC'leri ile sonuçlanır. Üretilen dilimin kalitesi, IR-DIC optiği altında görsel olarak değerlendirilir ve büyük, oval şekilli hücre gövdelerine sahip olduğu tanımlanan sağlıkl...

Burada, hipokampusun CA1'inin dorsal boyutundan yüksek kaliteli beyin dilimleri üretmek için bir protokol tanımlanmıştır ve bu bölgedeki birden fazla canlı nörondan kayıtlara izin verir. Koronal dilimlere yakın dilimlerden tüm hücre kaydının kombinatoryal yaklaşımı ve ardından nöron görselleştirmesi, hücre canlılığının ve kimliğinin doğrulanması için kritik öneme sahiptir.

Bu protokol, 2 ana nedenden dolayı güvenilir bir şe...

Yazar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan eder.

Yazar, el yazması ve protokol optimizasyonu hakkındaki yararlı yorumları için Prof. David JA Wyllie, Dr. Emma Perkins, Laura Simoes de Oliveira ve Prof. Peter C Kind'e ve yayın maliyetlerini sağladığı için The Simons Initiative for the Developing Brain'e teşekkür eder.