成虫のげっ歯類の海馬の背極からの急性脳スライスの準備

このプロトコルの目的は、電気生理学的検査のために背側海馬のスライスを生成する方法を説明することです。この手順では、スライス調製前に冷却されたACSFによる灌流を採用し、健康な主要なニューロンの保存を可能にするニアコロナルスライス角度を使用します。

急性げっ歯類の脳切片からの全細胞パッチクランプ記録は、現代の神経生理学的研究の主力であり、細胞およびシナプス特性の正確な測定を可能にします。それにもかかわらず、スライス電気生理学に加えて、異なる実験モード間で相関分析を行う必要性がますます高まっています。例えば、免疫組織化学、分子生物学、 in vivo イメージング、電気生理学的記録など。脳機能のますます複雑な質問に答えるために。しかし、これらのさまざまな実験的アプローチから意味のある結論を出すことは容易ではなく、比較的よく記述された脳構造内でさえ、細胞機能の高度な亜地域的変動が存在する。これは、細胞および分子特性に基づいて明確に定義された背腹特性を持つ海馬のCA1ほどよく例示されている場所はありません。それにもかかわらず、多くの発表された研究では、海馬の背側におけるタンパク質発現パターンまたは行動的に相関した in vivo 活性を調べています。そして、腹内側領域からの細胞電気生理学で所見を機構的に説明します。これは、他の実験モードがより成熟した動物で行われるのに対し、多くの急性スライス電気生理学的実験が幼若動物で行われるという事実によってさらに混乱します。これらの問題に対処するために、この方法では、成熟した(>60日齢のげっ歯類)の経心灌流を人工脳脊髄液で組み込んでおり、続いて背側海馬の中隔極を含む修飾冠状スライスを調製してCA1錐体細胞から記録します。このプロセスにより、背側海馬の健康な急性スライスが生成され、他の手段と一致するスライスベースの細胞電気生理学的調査が可能になります。

海馬は、その比較的大きなサイズと顕著な層状構造により、間違いなく哺乳類の脳で最もよく研究されている構造です。海馬は、空間ナビゲーション、文脈記憶、エピソード形成など、多くの行動プロセスに関与しています。これは、部分的には、 in vivo 分析のためのげっ歯類の海馬の背側部分へのアクセスが比較的容易であることによるものです。実際、主要な出力セルは通常、ピアル表面から2mm未満です。

げっ歯類では、海馬は比較的大きな構造であり、背中隔から腹側新皮質まで伸びる終脳の陥入によって形成されます。それは2つの主要な領域で構成されています:歯状回と角アンモニス(CA)。後者は、接続性、細胞解剖学、および^{遺伝的特性に基づいて}、歯状回(以前はCA4として知られていた)に伸びる3つのよく記述されたサブリージョン(CA1-3)に分割されます1。この構造は、シナプス特性^2,3,4、解剖学的構造⁵、遺伝的多様性^6,7,8、および行動機能^9,10に大きな変動があるにもかかわらず、海馬の背腹側範囲に沿って維持されています。CA領域のうち、CA1サブフィールドは、主にグルタミン酸作動性CA1錐体細胞(CA1 PC)で構成されており、3つのサブタイプが定義されています¹¹、およびニューロンの~10%を占める抑制性介在ニューロンですが、30を超えるサブタイプが定義されています12,13,14。地域的な特異的な違いに加えて、正常な老化は、シナプス伝達15,16,17、解剖学的構造¹⁸、および遺伝的プロファイル¹⁹に劇的な影響を与えることが示されている。細胞およびシナプス特性の複雑さを制御された方法で評価するための現在のゴールドスタンダードの方法は、急性脳スライス²⁰からの全細胞パッチクランプ記録を使用することである。

海馬機能の理解は、行動課題、電極やイメージングウィンドウの埋め込み、またはウイルスプラスミドの発現のために外科的または解剖学的に簡単にアクセスできるため、主に背側操作に基づいています。さらに、多くの研究では、これらの手順は、発達中の脳構造の変動を防ぐために、若年後期または成体のげっ歯類で実行されます。それにもかかわらず、細胞および細胞内の電気生理学を調べるための多くのアプローチは、主に海馬の腹内側部分から、その横断面21,22,23,24,25から、幼若期のげっ歯類の初期から中期に行われています。背腹側全範囲が評価された場合、組織チョッパーを使用して横方向範囲^4,26を維持するか、または実験が若いラット²⁷またはマウス²⁸で行われた。さらに、脳の解剖に先立って組織を冷却すると、ラット^では海馬の構造が、マウスでは新皮質ニューロン^30,31が保存されることが知られている。それにもかかわらず、成熟ラットでは、修飾された冠状スライスによって生成される海馬の背側横軸からの脳スライスの生成に関する詳細が不足しています。

このプロトコルは、高齢ラットの背側海馬の修飾冠状スライスの単一または対のニューロンから全細胞パッチクランプ記録を取得し、その後に事後形態学的同定を行うアプローチを説明しています。冷却人工脳脊髄液(ACSF)の経心涌流後に健康な脳切片が得られ、CA1 PCおよび局所介在ニューロンからの電気生理学的特性の測定が容易になります。

すべての動物は、内務省および機関のガイドライン(HO#P135148E)に従って生成および維持されました。すべてのラットは、12時間の明暗サイクルで維持され、餌と水への 自由な アクセスを与えられました。

1. チルドACSFの経心灌流

1. すべての実験に先立ち、~200 mL のスクロース ACSF (表 1) を -20 °C の冷凍庫 (半凍結まで、スライス用) に入れ、さらに ~100 ~ 200 mL のろ過済みスクロース ACSF を氷上 (灌流用) に入れ、カルボゲン (95% O₂/5% CO₂) でバブリングします。
2. 成体のラットをホームケージから回収し、処置室の保持ケージに~30分間置いて、騒音と光のレベルに順応させます。
3. 解剖ツール(図1A)、 ?? 流領域、注射可能な麻酔薬(約1 mLの200 mg / mLペントバルビタールナトリウム、最終濃度100 mg / kg)を準備します。.
4. ティッシュペーパーまたは脱脂綿の小さな綿棒を中に入れて、適切な麻酔チャンバーを準備します。チャンバー内の吸収材に1〜2mLの揮発性イソフルラン麻酔薬を導入します。
5. ラットを麻酔室に入れて鎮静させます。呼吸数が 1 秒あたり ~1 回の浅い呼吸に低下するまで、呼吸を監視します。
6. この時点で、スライス中に使用するために、半凍結ショ糖-ACSFを氷上でカルボゲンで泡立て始めます。
7. ラットの体重を量り、その体重に注意してください。
8. 調製したペントバルビタールナトリウムを腹腔内に注射することにより、ラットに終末麻酔をかけます。ペントバルビタールナトリウムの用量は、以前に摂取した薬物の重量とストック濃度から計算して、100 mg / kgである必要があります。.ラットを保持室に置き、終末麻酔の開始に0.5〜5分待ちます。.
9. 反射の停止を確認する:鈍いプローブ(つまり、丸みを帯びた鉗子)を使用して、角膜のまばたき(瞳孔に触れる)と後足のつまむ(脚を持ち上げて後足をつまむ)反射の両方をテストします。反射神経が止まったら、皮下注射針を使用してラットをポリスチレンまたはコルクの手術用ボードに固定します。
10. 胸腔を開き、カニューレを心臓の左心室の基部に配置します。右心房に穴を開け、氷冷(0-1°C)ショ糖ACSFですぐに灌流を開始します(50 mL /分の蠕動ポンプを使用)。
11. 体液の完全な交換と体の冷却が行われたら(<5分)、カニューレとピンを取り外し、ギロチンを使用して首を切る。
12. 骨はさみとRongeur骨ツールを使用して、頭蓋骨を慎重かつ迅速に取り除きます(図1A、1B)。
    1. まず、骨はさみを使用して大孔に両側の切り込みを2回行い、ロンガーで頭蓋骨をラムダ縫合糸に取り除きます。骨ハサミで正中線縫合糸に沿って目のすぐ後ろまで慎重に切ります。
    2. 頭蓋骨を正中線に垂直に2x両側に切り込みを入れます。Rongeursを使用して、正中線に沿って頭蓋骨を開きます。細いハサミやフック状の針を使用してピアマーターを取り除くには特に注意してください。
13. 鈍いヘラを使用して頭蓋骨から脳をすくい取り、脳神経と視神経を左右に圧迫して切断します。スライスする前に、脳をカルボジン化半凍結(0〜1°C)ショ糖ACSFに1〜2分間入れます。

2. 背側海馬からの脳切片の作製

1. 灌流した脳を半凍結(0〜1°C)ショ糖ACSFから取り出し、濾紙で裏打ちされたガラスのペトリ皿に入れます。脳を腹面に置きます。
2. メス(No.22ブレード)を使用して、脳の後部を垂直から~10°で取り除き、脳をステージに接着するための平らな面を作成します(図1C)。
3. ビブラトームのステージに少量のシアノアクリレート接着剤を塗布します。接着剤を広げて、脳の切断面の断面積よりも約50%大きい薄膜を作ります。
4. ガラス皿から脳を持ち上げて、カット面を下にしてヘラに乗せ、絵筆で組織をガイドします。ティッシュで脳を拭き取り、余分なACSFを取り除き、脳をスライドさせ、表面を切り取り、接着剤の中心にスライドさせます。パスツールピペットを使用して、氷のように冷たいスクロースACSFを1〜2 mL脳に加え、脳ブロックから接着剤を取り除きます。
5. 脳をスライスチャンバーに入れ、半凍結ショ糖ACSFを氾濫させます。スプーンまたはヘラを使用して、余分な氷を脳ブロックから遠ざけてから、カルボギン化します(図1D)。
6. ビブラトームのブレードを所定の位置に移動します:脳の背側表面から~1 mm、ブレグマの前方に垂直に~1 mm。ブレードが完全に水没していることを確認し、ペイントブラシを使用して気泡を取り除きます。
7. 脳をスライスし始めます。背側海馬までトリミングするには、0.1〜0.2 mm / sの速度を使用し、水平方向のブレードの動きは1〜1.5 mm、逆振動率は~90 Hzです。背側の海馬をスライスするときは、速度を0.05〜0.1 mm / sに下げます。
8. 脳ごとに背側の海馬のスライス(名目上3〜4個のフルスライスまたは6〜8個の半角スライス)を収集します。腹内側海馬の縦方向のスライスが必要な場合は、スライスを続けます。背側の海馬をスライスすると、第^3脳室 の位置からほぼそれを超えて余分な組織を切断する必要はありません。ビブラトームを停止し、曲げた皮下注射針でスライスを分離し、スライスチャンバーの基部に集めます。.
   注:スライスの厚さは、実験要件に応じて250〜500μmにすることができます。背側海馬からの記録には、通常、厚さ400 μmのスライスを使用して、適切な顕微鏡条件を確保しながら、ローカルネットワークをできるだけ多く保持します。
9. 解剖顕微鏡の下で海馬とその上にある皮質のみを含むようにスライスをトリミングします。スライスを予熱した35°Cチャンバーに、前面を上にして移します。
10. 実施する実験に基づいて貯蔵チャンバーを決定します。水中記録チャンバーのスライス表面に近い高品質の全細胞パッチクランプまたは細胞外フィールド記録を得るには、水中チャンバーで保存してください。あるいは、液体/気体インターフェースチャンバーに保存して、振動ネットワーク活動の記録やインターフェース細胞外フィールド記録を行います。
11. 水中の保管条件では、最後のスライスが保管チャンバーに入った時点から30分間、スライスを35°Cで回復させます。これにより、代謝プロセスの再活性化と切断された神経突起の再封止が可能になります。30分後、保管チャンバーを室温に移します。

3. 背側海馬ニューロンの記録

1. キャピラリーガラスから記録用パッチピペットを作製します。このプロトコルでは、外径1.5mm、内径0.86mmのホウケイ酸ガラスとフィラメントを使用しており、細胞内溶液を充填すると3〜5MΩのチップ抵抗が得られます(表1)。細胞内溶液は、高エネルギー成分の劣化を防ぐため氷上で冷やし、使用前にろ過してください(シリンジフィルター、細孔径:0.2μm)。
2. カルボゲン酸塩はACSFを記録し、ウォーターバス(35-40°C)で予温します。カルボジェン化および予熱されたACSFを、蠕動ポンプの補助を受けた灌流チューブを介して記録チャンバーに送達します。スライスをチャンバーに移す数分前に灌流を開始します。
3. 灌流を停止し、前面を上にして脳スライスを記録チャンバーに移します。「ハープ」の形を形成するためにシルクの単一繊維を取り付けたプラチナリングでスライスを所定の位置に保持します。CA1 の 層ピラミッドが 最初の記録ピペットの軸に対して垂直に走るようにスライスを配置します。
4. カルボジン化および予熱済み(35-40°C)記録ACSF(表1)の流れを6-8mL・^min-1の最適速度で再開します。
   注:高流速(6-8 mL・^min-1)は、スライス³²のネットワーク活性を維持するのに最適です。低流速(すなわち、2-3 mL・^min-1)は、イメージング実験や生物学的に関連性のあるネットワーク活性が不要な場合に、スライスの安定性を維持するために使用できます。
5. 40倍の対物レンズ倍率を持つIR-DIC(Infrared Differential Inference Contrast)光学系を使用してスライス品質を評価します(CCDカメラで視覚化)。滑らかで軽くくぼんだ表面から20〜30 μm下の 深さのピラミッドで 、卵形で適度に対照的なCA1 PCが多数見られる場合は、良好なスライス品質を想定してください(図2A)。低品質のスライスには、コントラストの高い、収縮した、または膨潤した細胞が多数含まれており、スライス表面は不均一です。
6. パッチピペットに細胞内溶液(例:24 mMの細胞内[Cl^-]に基づく)を充填して、他の公開データとの比較を可能にします。
7. 前述したように全細胞パッチクランプ記録を行う²²。ブレークスルー時の膜電位(_{V M})が-50 mVよりも脱分極され、直列抵抗が>30MΩの場合は、細胞を分析から除外します。または、直列抵抗が録音中に>20%変化します。これらの記録条件下では、直列抵抗は通常8〜25MΩの範囲にあり、最大1時間安定しています。
8. 背側海馬からのCA1内因性興奮性を調べるには、電流クランプ構成で次のプロトコルを使用して全細胞記録を使用して内因性生理学的特性をテストします。
   1. バイアス電流を印加していない静止膜電位から、小さな(-10 pA、500 ms)電流ステップを30回繰り返します。
   2. バイアス電流を印加した-70mVから、トレースファミリーを3回繰り返して、500msの持続時間(-100〜+400pA、25pAステップ)の脱分極電流ステップにハイパーを適用します。
   3. 0.1 Hz から 20 Hz までの可変周波数で、ピーク間振幅 100 pA の正弦波を印加します。これを 3 回繰り返します。
   4. 5x 2 nA、2 msの刺激を適用して、20、40、60、80、100 Hzで活動電位を駆動します。周波数ごとに10回の掃引。
   5. -70mVの電圧クランプから、5分間の自発興奮性シナプス後電流(EPSC)を印加して記録します。
9. 記録が成功した後に組織学的解析のために細胞を再シールするには、パッチピペットをゆっくりと引っ込めて外側外側のパッチを作成します。-5 mVのテストパルスで測定した実験レベルから>1 GΩまで直列抵抗の増加が観察された場合は、保持電位を-40 mVに上げ、ピペットを完全に後退させます。
10. 同じスライスで追加の記録を実行して、実験計画の必要な統計的検出力を満たします。
11. 記録されたニューロンを含む脳スライスを記録チャンバーから取り出し、24ウェルプレートに入れ、ACSFを4%パラホルムアルデヒド(0.1 Mリン酸緩衝液中)に交換し、一晩放置します。
12. 翌日、PFAを0.1 Mリン酸緩衝液に交換し、組織学的処理まで保存します。前述のように、蛍光標識ストレプトアビジンで細胞を視覚化します²²。

上述のプロトコルは、成熟ラットの背側海馬の中隔極から生存可能なスライスの調製を可能にする。このプロトコルの重要な要素は、スライス調製前に冷却されたスクロース-ACSFを灌流することで、スライス表面に近接した健康なCA1 PCが得られることです。作製されたスライスの品質は、IR-DIC光学系の下で視覚的に評価され、大きな卵形の細胞体を持つと同定された?...

ここでは、海馬のCA1の背側範囲から高品質の脳スライスを生成するためのプロトコルが説明され、この領域内の複数の生存可能なニューロンからの記録を可能にする。冠状近傍スライスからの全細胞記録とそれに続くニューロンの可視化というコンビナトリアルアプローチは、細胞の生存率と同一性の確認に不可欠です。

このプロトコルは、主?...

著者は、彼らが競合する金銭的利益を持っていないことを宣言します。

著者は、原稿とプロトコルの最適化について有益なコメントをいただいたDavid JA Wyllie教授、Emma Perkins博士、Laura Simoes de Oliveira教授、および出版費用を提供してくださったThe Simons Initiative for the Developing Brainに感謝します。