Preparación de cortes agudos de cerebro del polo dorsal del hipocampo de roedores adultos

El propósito de este protocolo es describir un método para producir cortes del hipocampo dorsal para el examen electrofisiológico. Este procedimiento emplea la perfusión con ACSF refrigerado antes de la preparación del corte con un ángulo de corte cercano al coronal que permite la preservación de las neuronas principales sanas.

Los registros de patch-clamp de células enteras de cortes agudos de cerebro de roedores son un pilar de la investigación neurofisiológica moderna, ya que permiten una medición precisa de las propiedades celulares y sinápticas. Sin embargo, existe una necesidad cada vez mayor de realizar análisis correlacionados entre diferentes modos experimentales además de la electrofisiología de cortes, por ejemplo: inmunohistoquímica, biología molecular, imágenes in vivo o registro electrofisiológico; para responder a preguntas cada vez más complejas sobre la función cerebral. Sin embargo, sacar conclusiones significativas a partir de estos diversos enfoques experimentales no es sencillo, ya que incluso dentro de estructuras cerebrales relativamente bien descritas, existe un alto grado de variación subregional de la función celular. En ninguna parte se ejemplifica esto mejor que en el CA1 del hipocampo, que tiene propiedades dorso-ventrales bien definidas, basadas en propiedades celulares y moleculares. Sin embargo, muchos estudios publicados examinan los patrones de expresión de proteínas o la actividad in vivo correlacionada conductualmente en la extensión dorsal del hipocampo; y explicar los hallazgos mecanicistas con la electrofisiología celular de la región ventromedial. Esto se confunde aún más por el hecho de que muchos experimentos electrofisiológicos de corte agudo se realizan en animales jóvenes, mientras que otros modos experimentales se realizan en animales más maduros. Para abordar estos problemas, este método incorpora la perfusión transcárdica de roedores maduros (>60 días de edad) con líquido cefalorraquídeo artificial, seguida de la preparación de cortes coronales modificados, incluido el polo septal del hipocampo dorsal, para registrar las células piramidales CA1. Este proceso conduce a la generación de cortes agudos sanos del hipocampo dorsal, lo que permite la interrogación electrofisiológica celular basada en cortes que coincide con otras medidas.

El hipocampo es posiblemente la estructura mejor estudiada en el cerebro de los mamíferos, debido a su tamaño relativamente grande y su estructura laminar prominente. El hipocampo ha sido implicado en una serie de procesos conductuales: la navegación espacial, la memoria contextual y la formación de episodios. Esto se debe, en parte, a la relativa facilidad de acceso a las porciones dorsales del hipocampo en roedores para análisis in vivo . De hecho, las principales celdas de salida suelen estar a menos de 2 mm de la superficie del pial.

En los roedores, el hipocampo es una estructura relativamente grande, formada por una invaginación del telencéfalo que se extiende desde el tabique dorsal hasta el neocórtex ventral. Se compone de 2 regiones principales: el giro dentado y el cornu ammonis (CA); el último de los cuales se divide en 3 subregiones bien descritas (CA1-3) que se extienden hasta el hilio de la circunvolución dentada (anteriormente conocido como CA4), en función de la conectividad, la anatomía celular y las propiedades genéticas¹. Esta estructura se mantiene a lo largo de la extensión dorso-ventral del hipocampo, aunque con variaciones importantes en las propiedades sinápticas ^2,3,4, la anatomía⁵, la diversidad genética ^6,7,8 y la función conductual ^9,10. De las regiones CA, el subcampo CA1 está compuesto en gran parte por células piramidales glutamatérgicas CA1 (CA1 PCs), para las cuales se han definido 3 subtipos¹¹, e interneuronas inhibidoras que constituyen ~10% de las neuronas, pero son muy diversas con más de 30 subtipos definidos 12,13,14. Además de las diferencias específicas regionales, se ha demostrado que el envejecimiento normal tiene efectos dramáticos en la transmisión sináptica ^15,16,17, la anatomía¹⁸ y el perfil genético¹⁹. El método de referencia actual para evaluar las complejidades de las propiedades celulares y sinápticas de una manera controlada es mediante el uso de registros de patch-clamp de células enteras de cortes agudos de cerebro²⁰.

La comprensión de la función del hipocampo se basa en gran medida en la manipulación dorsal debido a la facilidad con la que se accede a él quirúrgica o anatómicamente para tareas conductuales, implantación de electrodos o ventanas de imagen, o expresión de plásmidos virales. Además, en muchos estudios, estos procedimientos se realizan con roedores adultos o juveniles tardíos para evitar la variabilidad en la estructura del cerebro durante el desarrollo. A pesar de esto, muchos enfoques para examinar la electrofisiología celular y subcelular se realizan en roedores juveniles tempranos a medios, principalmente desde la porción ventromedial del hipocampo en su plano transversal 21,22,23,24,25. Cuando se ha evaluado toda la extensión dorso-ventral, se utiliza un picador de tejidos para mantener la extensión transversal ^4,26, o el experimento se ha realizado en ratas jóvenes²⁷ o ratones²⁸. Además, se sabe que el enfriamiento del tejido antes de la disección del cerebro preserva la estructura del hipocampo en ratas²⁹ y las neuronas neocorticales en ratones^30,31. Sin embargo, hay una escasez de detalles con respecto a la producción de cortes de cerebro a partir del eje transversal dorsal del hipocampo, generados por cortes coronales modificados, en ratas maduras.

Este protocolo describe un enfoque mediante el cual se pueden obtener registros de patch-clamp de células completas a partir de neuronas individuales o pares de neuronas en cortes coronales modificados del hipocampo dorsal de ratas envejecidas, seguidas de una identificación morfológica post-hoc. Se obtienen cortes de cerebro sanos después de la perfusión transcardíaca de líquido cefalorraquídeo artificial refrigerado (ACSF), lo que facilita la medición de las propiedades electrofisiológicas de los PC CA1 y las interneuronas locales.

Todos los animales fueron generados y mantenidos de acuerdo con las directrices del Ministerio del Interior e Institucionales (HO# P135148E). Todas las ratas se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se les dio acceso ad libitum a comida y agua.

1. Perfusión transcárdica de ACSF refrigerado

1. Antes de todos los experimentos, coloque ~200 mL de sacarosa-ACSF (Tabla 1) en el congelador a -20 °C (hasta que esté semicongelada, para cortar) y otros ~100-200 mL de sacarosa-ACSF filtrada en hielo (para perfusión), burbujeando con carbgeno (95% Ø₂/5% CO₂).
2. Recoja una rata adulta de su jaula doméstica y colóquela durante ~ 30 minutos en una jaula de retención en la sala de procedimientos para aclimatarse a los niveles de ruido y luz.
3. Prepare las herramientas de disección (Figura 1A), el área de perfusión y el anestésico inyectable (aprox. 1 mL de 200 mg/mL de pentobarbital sódico para una concentración final de 100 mg/kg).
4. Prepare una cámara de anestesia adecuada colocando un pequeño hisopo de papel de seda o algodón en su interior. Introduzca 1-2 mL de anestésico isoflurano volátil en el material absorbente de la cámara.
5. Coloca a la rata en una cámara de anestesia para que se sede. Controle la respiración hasta que la frecuencia respiratoria baje a ~ 1 respiración superficial por segundo.
6. En este punto, comience a burbujear sacarosa-ACSF semicongelada con carbógeno en hielo para usar durante el corte.
7. Pesa la rata y anota su peso.
8. Anestesiar terminalmente a la rata inyectando el pentobarbital sódico preparado en la cavidad intraperitoneal. La dosis de pentobarbital sódico debe ser de 100 mg/kg, calculada a partir del peso previamente tomado y la concentración de stock del fármaco. Coloque la rata en una cámara de retención y espere de 0,5 a 5 minutos para el inicio de la anestesia terminal.
9. Confirmar el cese de los reflejos: pruebe los reflejos de parpadeo corneal (tocar la pupila) y de pellizco de la pata trasera (levantar la pata y pellizcar la pata trasera) con una sonda roma (es decir, pinzas redondeadas). Una vez que hayan cesado los reflejos, sujete la rata a la placa quirúrgica de poliestireno o corcho con agujas hipodérmicas.
10. Abra la cavidad torácica y coloque la cánula en la base del ventrículo izquierdo del corazón. Punción de la aurícula derecha e inicio inmediato de la perfusión con la sacarosa-ACSF helada (0-1 °C) (utilizando una bomba peristáltica a 50 mL/minuto).
11. Una vez que se haya producido el intercambio completo de líquidos y el enfriamiento del cuerpo (<5 minutos), retire la cánula y los clavos, y luego decapita con una guillotina.
12. Extraiga el cráneo con cuidado y rapidez con tijeras para huesos y herramientas para huesos Rongeur (Figura 1A,1B).
    1. Comience haciendo 2 cortes bilaterales a través del foramen magnum con las tijeras de hueso y retire el cráneo a la sutura lambda con los Rongeurs. Corta con cuidado a lo largo de la sutura de la línea media con las tijeras para huesos justo detrás de los ojos.
    2. Haz 2 cortes bilaterales a través del cráneo, perpendiculares a la línea media. Usando los Rongeurs, abre el cráneo a lo largo de la línea media. Tenga especial cuidado de eliminar la piamadre con unas tijeras finas o una aguja en forma de gancho.
13. Saca el cerebro del cráneo con una espátula roma, cortando los nervios craneales y ópticos con compresión de lado a lado. Coloque el cerebro en sacarosa-ACSF carbogenada y semicongelada (0-1 °C) durante 1-2 minutos antes de cortar.

2. Preparación de cortes de cerebro del hipocampo dorsal

1. Retire el cerebro perfundido de la sacarosa-ACSF semicongelada (0–1 °C) y colóquelo en una placa de Petri de vidrio forrada con papel de filtro. Coloque el cerebro sobre su superficie ventral.
2. Con un bisturí (hoja n.º 22), retire la parte posterior del cerebro a ~10° de la vertical para crear una superficie plana para pegar el cerebro a la platina (Figura 1C).
3. Aplica una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato en la etapa del vibratomo. Extienda el pegamento para hacer una película delgada aproximadamente un 50% más grande que el área de la sección transversal de la superficie cortada del cerebro.
4. Levante el cerebro del plato de vidrio y colóquelo en una espátula, con el lado cortado hacia abajo, usando un pincel para guiar el pañuelo. Seque el cerebro con un trozo de tejido para eliminar el exceso de ACSF y deslice el cerebro, con la superficie cortada hacia abajo, sobre el centro del pegamento. Con una pipeta Pasteur, agregue 1-2 ml de sacarosa helada-ACSF sobre el cerebro para eliminar el pegamento del bloqueo cerebral.
5. Coloque el cerebro en la cámara de corte e inñe con sacarosa ACSF semicongelada. Use una cuchara o espátula para mantener el exceso de hielo alejado del bloqueo cerebral y luego carbogenate (Figura 1D).
6. Mueva la hoja del vibratomo a su posición: ~ 1 mm de la superficie dorsal del cerebro y verticalmente ~ 1 mm anterior al bregma. Asegúrese de que la hoja esté completamente sumergida y elimine las burbujas con un pincel.
7. Empieza a cortar el cerebro. Para recortar hasta el hipocampo dorsal, utilice una velocidad de 0,1-0,2 mm/s, con un movimiento horizontal de la hoja de 1-1,5 mm y una tasa oscilatoria recíproca de ~90 Hz. Al cortar el hipocampo dorsal, reduzca la velocidad a 0,05-0,1 mm/s.
8. Recoja rebanadas de hipocampo dorsal (nominalmente 3-4 rebanadas completas o 6-8 rebanadas hemiseccionadas) por cerebro. Si se requieren cortes longitudinales del hipocampo ventromedial, continúe cortando. Una vez que se ha cortado el hipocampo dorsal, no es necesario cortar tejido adicional más allá de aproximadamente la posición del^3er ventrículo. Detenga el vibrátomo, separe la rebanada con una aguja hipodérmica doblada y recoja en la base de la cámara de corte.
   NOTA: Las rodajas pueden tener un grosor de 250-500 μm, dependiendo de los requisitos experimentales. Para las grabaciones del hipocampo dorsal, normalmente se utilizan cortes de 400 μm de grosor para preservar la mayor parte de la red local, al tiempo que se permiten las condiciones de microscopía adecuadas.
9. Recorta las rodajas para que contengan solo el hipocampo y la corteza suprayacente bajo un microscopio de disección. Transfiera las lonchas a la cámara precalentada a 35 °C con la superficie anterior hacia arriba.
10. Determine la cámara de almacenamiento en función del experimento que se va a realizar. Para obtener grabaciones de alta calidad de alta calidad en patch-clamp o de campo extracelular cerca de la superficie de corte en cámaras de grabación sumergidas, almacene en cámaras sumergidas. Alternativamente, almacene en una cámara de interfaz líquido/gas para registros de actividad de red oscilatoria o registros de campo extracelular de interfaz.
11. Para condiciones de almacenamiento sumergido, deje que las lonchas se recuperen a 35 ºC durante 30 minutos desde el momento en que la última loncha entró en la cámara de almacenamiento. Esto permite la reactivación de los procesos metabólicos y el resellado de las neuritas cortadas. Después de 30 minutos, transfiera la cámara de almacenamiento a temperatura ambiente.

3. Registro de las neuronas dorsales del hipocampo

1. Fabricación de pipetas de parche de grabación a partir de vidrio capilar. Este protocolo utiliza vidrio de borosilicato de 1,5 mm de diámetro exterior y 0,86 mm de diámetro interior con filamento, que produce una resistencia de la punta de 3-5 MΩ cuando se llena con solución intracelular (Tabla 1). Mantener las soluciones intracelulares refrigeradas en hielo para evitar la degradación de los componentes energéticos y filtrarlas antes de su uso (filtro de jeringa, tamaño de poro: 0,2 μm).
2. Grabación de carbogenato: ACSF y precalentamiento en baño maría (35-40 ºC). Suministre el ACSF carbugenado y precalentado a la cámara de registro a través de un tubo de perfusión asistido por una bomba peristáltica. Inicie la perfusión varios minutos antes de transferir un corte a la cámara.
3. Detenga la perfusión y transfiera un corte de cerebro a la cámara de registro con la superficie anterior hacia arriba. Sostenga la rebanada en su lugar con un anillo de platino con fibras individuales de seda unidas para formar una forma de "arpa". Coloque los cortes de modo que el estrato piramidal de CA1 sea perpendicular al eje de la primera pipeta de registro.
4. Reiniciar el flujo de ACSF carbogenado y precalentado (35-40 ºC) registrando ACSF (Tabla 1) a una velocidad óptima de 6-8 mL∙^min-1.
   NOTA: Los caudales altos (6-8 mL∙^min-1) son óptimos para mantener la actividad de la red en las porciones³². Se pueden utilizar caudales más bajos (es decir, 2-3 mL∙^min-1) para mantener la estabilidad del corte para experimentos de imágenes o donde no se requiere actividad de red biológicamente relevante.
5. Evalúe la calidad del corte utilizando óptica de contraste de inferencia diferencial infrarrojo (IR-DIC) con aumento de objetivo de 40x (visualizado con una cámara CCD). Supongamos una buena calidad de corte si se puede ver un gran número de PCs CA1 de forma ovoide y moderadamente contrastadas en la pirámide estridentada a profundidades de 20-30 μm por debajo de una superficie lisa y ligeramente con hoyuelos (Figura 2A). Los cortes de mala calidad contienen un gran número de células muy contrastadas, encogidas o hinchadas, con una superficie de corte desigual.
6. Llene las pipetas de parche con una solución intracelular (por ejemplo, basada en un [Cl^-] intracelular de 24 mM) para permitir la comparación con otros datos publicados.
7. Realice registros de patch-clamp de celda completa como se describió anteriormente²². Excluir las células del análisis si el potencial de membrana (V_M) en la ruptura está más despolarizado que -50 mV, la resistencia en serie es de >30 MΩ; o la resistencia en serie cambia en un >20% en el transcurso de la grabación. En estas condiciones de grabación, la resistencia en serie suele estar en el rango de 8 a 25 MΩ y es estable hasta 1 hora.
8. Para examinar la excitabilidad intrínseca de CA1 desde el hipocampo dorsal, pruebe las propiedades fisiológicas intrínsecas con registros de células completas con los siguientes protocolos en la configuración de pinza de corriente:
   1. Desde el potencial de membrana en reposo sin corriente de polarización aplicada, aplique pequeños pasos de corriente (-10 pA, 500 ms) repetidos 30 veces.
   2. A partir de -70 mV con corriente de polarización aplicada, aplique pasos de corriente de hiperpolarización a despolarización de 500 ms de duración (-100 a +400 pA, pasos de 25 pA) con 3 repeticiones de una familia de trazas.
   3. Aplique una onda sinusoidal de 100 pA de amplitud pico a pico, con frecuencia variable de 0,1 a 20 Hz. Repita 3 veces.
   4. Aplique 5 estímulos de 2 nA, 2 ms para impulsar los potenciales de acción a 20, 40, 60, 80, 100 Hz. 10 barridos por frecuencia.
   5. Desde una pinza de voltaje de -70 mV, aplique 5 minutos de corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas (EPSC) para el registro.
9. Para volver a sellar las células para el análisis histológico después de un registro exitoso, produzca parches de afuera retrayendo lentamente la pipeta de parche. Cuando se observe un aumento en la resistencia en serie desde los niveles experimentales hasta >1 GΩ medido por un pulso de prueba de -5 mV, aumente el potencial de retención a -40 mV y retraiga la pipeta por completo.
10. Realizar registros adicionales en el mismo corte para satisfacer la potencia estadística requerida del diseño experimental.
11. Retire los trozos de cerebro que contengan neuronas registradas de la cámara de registro, colóquelos en una placa de 24 pocillos, reemplace el ACSF con paraformaldehído al 4% (en tampón de fosfato de 0,1 M) y déjelo toda la noche.
12. Al día siguiente, sustituya el PFA por un tampón de fosfato de 0,1 M y guárdelo hasta el procesamiento histológico. Visualice las células con estreptavidina conjugada fluorescente como se describió anteriormente²².

El protocolo descrito anteriormente permite la preparación de cortes viables desde el polo septal del hipocampo dorsal en ratas maduras. Un factor clave en este protocolo es la perfusión de sacarosa refrigerada-ACSF, antes de la preparación del corte, lo que da como resultado CA1 PC sanos proximales a la superficie del corte. La calidad del corte producido se evalúa visualmente bajo la óptica IR-DIC, y las células sanas identificadas con cuerpos celulares grandes y de forma ovoide ...

Aquí, se describe un protocolo para producir cortes de cerebro de alta calidad a partir de la extensión dorsal del CA1 del hipocampo, lo que permite grabaciones de múltiples neuronas viables dentro de esta región. El enfoque combinatorio del registro de células completas a partir de cortes cercanos a la corona seguido de la visualización de neuronas es fundamental para la confirmación de la viabilidad y la identidad de la célula.

Este protocolo produce...

El autor declara que no tiene intereses financieros contrapuestos.

El autor desea agradecer al Prof. David JA Wyllie, a la Dra. Emma Perkins, a Laura Simoes de Oliveira y al Prof. Peter C Kind por sus útiles comentarios sobre el manuscrito y la optimización del protocolo, y a The Simons Initiative for the Developing Brain por proporcionar los costos de publicación.