הכנת פרוסות מוח חריפות מהקוטב הגבי של ההיפוקמפוס ממכרסמים בוגרים

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר שיטה לייצור פרוסות של ההיפוקמפוס הגבי לבדיקה אלקטרופיזיולוגית. הליך זה משתמש בזילוף עם ACSF מקורר לפני הכנת הפרוסה עם זווית חיתוך כמעט קורונלית המאפשרת שימור של נוירונים עיקריים בריאים.

רישומי מהדק טלאי של תאים שלמים מפרוסות מוח של מכרסמים חריפים הם עמוד התווך של המחקר הנוירופיזיולוגי המודרני, ומאפשרים מדידה מדויקת של תכונות תאיות וסינפטיות. עם זאת, יש צורך הולך וגובר לבצע ניתוחים מתאמים בין מצבי ניסוי שונים בנוסף לאלקטרופיזיולוגיה של פרוסות, למשל: אימונוהיסטוכימיה, ביולוגיה מולקולרית, הדמיה in vivo או רישום אלקטרופיזיולוגי; לענות על שאלות מורכבות יותר ויותר של תפקוד המוח. עם זאת, הסקת מסקנות משמעותיות מגישות ניסיוניות שונות אלה אינה פשוטה, שכן אפילו בתוך מבני מוח המתוארים היטב יחסית, קיימת רמה גבוהה של שונות תת-אזורית של תפקוד התא. אין מקום שבו זה מודגם טוב יותר מאשר ב-CA1 של ההיפוקמפוס, שיש לו תכונות גב-גחון מוגדרות היטב, המבוססות על תכונות תאיות ומולקולריות. עם זאת, מחקרים רבים שפורסמו בוחנים דפוסי ביטוי חלבונים או קורלציה התנהגותית בפעילות in vivo בהיקף הגבי של ההיפוקמפוס; ולהסביר ממצאים באופן מכני עם אלקטרופיזיולוגיה תאית מאזור הגחון-מדיאלי. זה מבולבל עוד יותר על ידי העובדה שניסויים אלקטרופיזיולוגיים חריפים רבים מבוצעים בבעלי חיים צעירים, כאשר מצבי ניסוי אחרים מבוצעים בבעלי חיים בוגרים יותר. כדי לטפל בבעיות אלה, שיטה זו משלבת זלוף טרנס-קרדיאלי של מכרסמים בוגרים (>60 יום) עם נוזל מוחי מלאכותי ואחריו הכנת פרוסות קורונליות שעברו שינוי כולל קוטב המחיצה של ההיפוקמפוס הגבי לתיעוד מתאי פירמידה CA1. תהליך זה מוביל ליצירת פרוסות בריאות וחדות של ההיפוקמפוס הגבי המאפשרות חקירה אלקטרופיזיולוגית תאית מבוססת פרוסה המותאמת למדדים אחרים.

ההיפוקמפוס הוא ללא ספק המבנה הנחקר ביותר במוח היונקים, בשל גודלו הגדול יחסית והמבנה הלמינרי הבולט שלו. ההיפוקמפוס היה מעורב במספר תהליכים התנהגותיים: ניווט מרחבי, זיכרון הקשרי והיווצרות אפיזודות. זה, בין השאר, נובע מהקלות היחסית של גישה לחלקים הגביים של ההיפוקמפוס במכרסמים לניתוח in vivo . ואכן, תאי הפלט העיקריים נמצאים בדרך כלל במרחק של פחות מ-2 מ"מ מפני השטח של הפיאל.

במכרסמים, ההיפוקמפוס הוא מבנה גדול יחסית, שנוצר מפלישה של הטלנצפלון המשתרע ממחיצת הגב לניאו-קורטקס הגחוני. הוא מורכב משני אזורים עיקריים: הפיתול המשונן, והקורנו אמוניס (CA); האחרון שבהם מחולק ל-3 תת-אזורים מתוארים היטב (CA1-3) המשתרעים לתוך ה-gyrus hilus המשונן (שנקרא בעבר CA4), בהתבסס על קישוריות, אנטומיה תאית ותכונות גנטיות¹. מבנה זה נשמר לאורך האזור הגבי-גחוני של ההיפוקמפוס, אם כי עם שינויים גדולים בתכונות הסינפטיות ^2,3,4, אנטומיה⁵, מגוון גנטי ^6,7,8 ותפקוד התנהגותי ^9,10. מבין אזורי CA, תת-השדה CA1 מורכב ברובו מתאי פירמידה CA1 גלוטמטרגיים (CA1 PCs), שעבורם הוגדרו 3 תת-סוגים¹¹, ואינטרנוירונים מעכבים המהווים ~10% מהנוירונים, אך הם מגוונים מאוד עם למעלה מ-30 תת-סוגים המוגדרים 12,13,14. בנוסף להבדלים ספציפיים אזוריים, הוכח כי להזדקנות נורמלית יש השפעות דרמטיות על העברה סינפטית ^15,16,17, אנטומיה¹⁸ ופרופיל גנטי¹⁹. השיטה הנוכחית של תקן הזהב להערכת המורכבויות של תכונות תאיות וסינפטיות בצורה מבוקרת היא באמצעות הקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים מפרוסות מוח חריפות²⁰.

ההבנה של תפקוד ההיפוקמפוס מבוססת במידה רבה על מניפולציה גבית בשל הקלות שבה ניגשים אליו כירורגית או אנטומית למשימות התנהגותיות, השתלת אלקטרודות או חלונות הדמיה, או ביטוי פלסמיד ויראלי. בנוסף, במחקרים רבים, הליכים אלה מבוצעים עם מכרסמים צעירים מאוחרים או בוגרים כדי למנוע שונות במבנה המוח במהלך ההתפתחות. למרות זאת, גישות רבות לבחינת אלקטרופיזיולוגיה תאית ותת-תאית מבוצעות במכרסמים צעירים מוקדמים עד אמצעיים, בעיקר מהחלק הגחוני המדיאלי של ההיפוקמפוס במישור הרוחבי שלו 21,22,23,24,25. כאשר כל ההיקף הגב-גחוני הוערך, נעשה שימוש בקוצץ רקמות כדי לשמור על ההיקף הרוחבי ^4,26, או שהניסוי בוצע בחולדות צעירות²⁷ או בעכברים²⁸. יתר על כן, קירור רקמות לפני דיסקציה של המוח ידוע כמשמר את מבנה ההיפוקמפוס בחולדות²⁹ ונוירונים ניאו-קורטיקליים בעכברים^30,31. עם זאת, קיים מחסור בפרטים לגבי ייצור פרוסות מוח מהציר הרוחבי הגבי של ההיפוקמפוס, כפי שנוצר על ידי פרוסות עטרה ששונו, בחולדות בוגרות.

פרוטוקול זה מתאר גישה שבאמצעותה ניתן לקבל הקלטות של מהדק טלאי של תא שלם מבודד או זוגות של נוירונים בפרוסות עטרה מותאמות של היפוקמפוס גבי מחולדות מבוגרות, ולאחר מכן זיהוי מורפולוגי פוסט-הוק. פרוסות מוח בריאות מתקבלות לאחר זלוף דרך הלב של נוזל מוחי שדרה מלאכותי מקורר (ACSF), מה שמקל על מדידת תכונות אלקטרופיזיולוגיות ממחשבי CA1 ואינטרנוירונים מקומיים.

כל בעלי החיים נוצרו ותוחזקו בהתאם להנחיות משרד הפנים והמוסדות (HO# P135148E). כל החולדות נשמרו במחזור אור/חושך של 12 שעות וניתנה להן גישה אד-ליביטום למזון ומים.

1. זלוף טרנס-קרדיאלי של ACSF צונן

1. לפני כל הניסויים, הניחו ~200 מ"ל סוכרוז-ACSF (טבלה 1) במקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס (עד להקפאה למחצה, לחיתוך) ועוד ~100-200 מ"ל סוכרוז-ACSF מסונן על קרח (לזילוף), מבעבע עם קרבוגן (95% O₂/5% CO₂).
2. אספו חולדה בוגרת מהכלוב הביתי שלה והניחו אותה למשך ~30 דקות בכלוב החזקה בחדר ההליכים כדי להתאקלם לרמות הרעש והאור.
3. הכן את כלי הדיסקציה (איור 1A), את אזור הזלוף ואת חומר ההרדמה הניתן להזרקה (כ-1 מ"ל של 200 מ"ג/מ"ל נתרן פנטוברביטל לריכוז סופי של 100 מ"ג/ק"ג).
4. הכן תא הרדמה מתאים על ידי הנחת ספוגית קטנה של נייר טישו או צמר גפן בתוכו. הכניסו 1-2 מ"ל של חומר הרדמה איזופלורן נדיף לחומר הסופג בתא.
5. הנח את החולדה בתא הרדמה להרגעה. עקוב אחר הנשימה עד שקצב הנשימה יורד ל~1 נשימה רדודה בשנייה.
6. בשלב זה, התחל לבעבע סוכרוז-ACSF קפוא למחצה עם קרבוגן על קרח לשימוש במהלך החיתוך.
7. שקלו את החולדה ושימו לב למשקלה.
8. הרדמה סופית של החולדה על ידי הזרקת הנתרן פנטוברביטל המוכן לחלל התוך צפק. המינון של נתרן פנטוברביטל צריך להיות 100 מ"ג/ק"ג, מחושב מהמשקל שנלקח בעבר וריכוז המלאי של התרופה. הנח את החולדה בתא החזקה ואפשר 0.5-5 דקות לתחילת ההרדמה הסופנית.
9. אשר הפסקת רפלקסים: בדוק גם את מצמוץ הקרנית (גע באישון) וגם את הרפלקסים של צביטת כף הרגל (הרם את הרגל וצבט את הכף האחורית) באמצעות בדיקה קהה (כלומר, מלקחיים מעוגלים). לאחר הפסקת הרפלקסים, הצמד את החולדה ללוח הניתוחי של פוליסטירן או פקק באמצעות מחטים תת-עוריות.
10. פתח את חלל החזה והנח את הצינורית בבסיס החדר השמאלי של הלב. יש לנקב את הפרוזדור הימני ולהתחיל מיד בזילוף עם סוכרוז-ACSF קר כקרח (0-1 מעלות צלזיוס) (באמצעות משאבה פריסטלטית במהירות של 50 מ"ל לדקה).
11. לאחר שהתרחשה החלפה מלאה של נוזלים וקירור הגוף (<5 דקות), הסר את הצינורית והסיכות, ולאחר מכן ערף את הראש באמצעות גיליוטינה.
12. הסירו את הגולגולת בזהירות ובמהירות באמצעות מספרי עצם וכלי עצם של Rongeur (איור 1A,1B).
    1. התחל בביצוע חתכים דו צדדיים דרך הנקב מגנום באמצעות מספרי העצם והסר את הגולגולת לתפר הלמבדה עם הרונג'ור. חותכים בזהירות לאורך תפר קו האמצע עם מספרי העצם ממש מאחורי העיניים.
    2. בצע 2 חתכים דו צדדיים דרך הגולגולת, בניצב לקו האמצע. בעזרת ה-Rongeurs, פתח את הגולגולת לאורך קו האמצע. הקפד במיוחד להסיר פיה מאטר באמצעות מספריים עדינים או מחט מחוברת.
13. הוציאו את המוח מהגולגולת באמצעות מרית קהה, חתכו את עצבי הגולגולת והראייה בדחיסה מצד לצד. הכניסו את המוח לסוכרוז-ACSF קרבוגן, קפוא למחצה (0-1 מעלות צלזיוס) למשך 1-2 דקות לפני החיתוך.

2. הכנת פרוסות מוח מההיפוקמפוס הגבי

1. מוציאים את המוח המפוזר מהסוכרוז-ACSF הקפוא למחצה (0-1 מעלות צלזיוס) ומניחים בצלחת פטרי מזכוכית מרופדת בנייר פילטר. הניחו את המוח על פני הגחון שלו.
2. באמצעות אזמל (להב מס' 22), הסירו את החלק האחורי של המוח ב-~10 מעלות מהאנכי כדי ליצור משטח שטוח כדי להדביק את המוח לבמה (איור 1C).
3. מרחו כמות קטנה של דבק ציאנואקרילט על שלב הוויברטום. מורחים את הדבק כדי ליצור סרט דק גדול בכ-50% משטח החתך של משטח החתך של המוח.
4. הרם את המוח מכלי הזכוכית על מרית, חתוך כלפי מטה, בעזרת מברשת כדי להנחות את הרקמה. כתם את המוח בחתיכת רקמה כדי להסיר עודף ACSF והחלק את המוח, חתוך את פני השטח כלפי מטה, אל מרכז הדבק. בעזרת פיפטת פסטר, הוסיפו 1-2 מ"ל סוכרוז-ACSF קר כקרח על המוח כדי להסיר דבק מחסימת המוח.
5. הכניסו את המוח לתא החיתוך והציפו בסוכרוז חצי קפוא ACSF. השתמשו בכפית או במרית כדי להרחיק עודפי קרח מחסימת המוח, ואז השתמשו בקרבוגנאט (איור 1D).
6. הזיזו את להב הוויברטום למקומו: ~1 מ"מ מהמשטח הגבי של המוח ואנכית ~1 מ"מ לפני הברגמה. ודא שהלהב שקוע לחלוטין, והסר בועות באמצעות מברשת.
7. התחילו לחתוך את המוח. כדי לקצץ עד להיפוקמפוס הגבי, השתמש במהירות של 0.1-0.2 מ"מ לשנייה, עם תנועת להב אופקית של 1-1.5 מ"מ וקצב תנודה הדדי של ~90 הרץ. בעת חיתוך ההיפוקמפוס הגבי יש להפחית את המהירות ל-0.05-0.1 מ"מ לשנייה.
8. אספו פרוסות של היפוקמפוס גבי (באופן נומינלי 3-4 פרוסות מלאות או 6-8 פרוסות חצויות) לכל מוח. אם נדרשות פרוסות אורכיות של היפוקמפוס ונטרו-מדיאלי, המשך לפרוס. לאחר שההיפוקמפוס הגבי נחתך, אין צורך לחתוך רקמה נוספת מעבר למיקום החדר^השלישי . עצרו את הוויברטום, הפרידו את הפרוסה בעזרת מחט היפודרמית כפופה ואספו בבסיס תא החיתוך.
   הערה: פרוסות יכולות להיות בעובי 250-500 מיקרומטר, בהתאם לדרישות הניסוי. עבור הקלטות מההיפוקמפוס הגבי, השתמש בדרך כלל בפרוסות בעובי 400 מיקרומטר כדי לשמר כמה שיותר מהרשת המקומית, תוך מתן אפשרות לתנאי המיקרוסקופיה המתאימים.
9. חתוך את הפרוסות כך שיכילו רק את ההיפוקמפוס ואת קליפת המוח שמעליו תחת מיקרוסקופ מנתח. מעבירים את הפרוסות לתא שחומם מראש של 35 מעלות צלזיוס כשהמשטח הקדמי פונה כלפי מעלה.
10. קבע את תא האחסון על סמך הניסוי שיבוצע. כדי להשיג הקלטות טלאי תא שלם או שדה חוץ-תאי באיכות גבוהה קרוב לפני השטח של הפרוסה בתאי הקלטה שקועים, יש לאחסן בתאים שקועים. לחלופין, יש לאחסן בתא ממשק נוזל/גז להקלטות של פעילות רשת תנודתית או הקלטות שדה חוץ-תאיות בממשק.
11. לתנאי אחסון שקועים, אפשר לפרוסות להתאושש בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות מרגע כניסת הפרוסה האחרונה לתא האחסון. זה מאפשר הפעלה מחדש של תהליכים מטבוליים ואיטום מחדש של נויריטים חתוכים. לאחר 30 דקות, העבירו את תא האחסון לטמפרטורת החדר.

3. רישום הנוירונים הגביים בהיפוקמפוס

1. לייצר פיפטות תיקון הקלטה מזכוכית נימית. פרוטוקול זה משתמש בזכוכית בורוסיליקט בקוטר חיצוני של 1.5 מ"מ, בקוטר פנימי של 0.86 מ"מ עם נימה, המניבה התנגדות קצה של 3-5 MΩ כאשר היא ממולאת בתמיסה תוך-תאית (טבלה 1). שמור על תמיסות תוך-תאיות מקוררות על קרח כדי למנוע השפלה של רכיבים אנרגטיים ומסוננים לפני השימוש (מסנן מזרק, גודל נקבוביות: 0.2 מיקרומטר).
2. קרבוגנאט מקליט ACSF ומחמם מראש באמבט מים (35-40 מעלות צלזיוס). העבירו את ה-ACSF הקרבוגן והמחומם מראש לתא ההקלטה באמצעות צינורות זלוף בסיוע משאבה פריסטלטית. התחל זלוף מספר דקות לפני העברת פרוסה לתא.
3. עצרו את הזלוף והעבירו פרוסת מוח לתא ההקלטה כשהמשטח הקדמי פונה כלפי מעלה. החזיקו את הפרוסה במקומה עם טבעת פלטינה עם סיבי משי בודדים המחוברים ליצירת צורת "נבל". מקם את הפרוסות כך ששכבת הפירמידה של CA1 עוברת בניצב לציר של פיפטת ההקלטה הראשונה.
4. הפעל מחדש את הזרימה של הקלטת ACSF קרבוגן ומחומם מראש (35-40 מעלות צלזיוס) (טבלה 1) בקצב אופטימלי של 6-8 מ"ל∙דקה-1.
   הערה: קצבי זרימה גבוהים (6-8 מ"ל∙^דקה-1) הם אופטימליים לשמירה על פעילות הרשת בפרוסות³². ניתן להשתמש בקצבי זרימה נמוכים יותר (כלומר, 2-3 מ"ל∙^דקה-1) כדי לשמור על יציבות הפרוסה עבור ניסויי הדמיה או כאשר אין צורך בפעילות רשת רלוונטית מבחינה ביולוגית.
5. הערך את איכות הפרוסה באמצעות אופטיקה של ניגודיות הסקה דיפרנציאלית אינפרא אדום (IR-DIC) עם הגדלה אובייקטיבית של פי 40 (הדמיה עם מצלמת CCD). נניח איכות פרוסה טובה אם ניתן לראות מספר רב של מחשבי CA1 בצורת ביצה, בעלי ניגודיות בינונית בפירמידלה בעומקים של 20-30 מיקרומטר מתחת למשטח חלק וגומות קלות (איור 2A). פרוסות באיכות ירודה מכילות מספר רב של תאים בעלי ניגודיות גבוהה, מכווצים או נפוחים, עם משטח פרוסה לא אחיד.
6. מלאו פיפטות תיקון בתמיסה תוך-תאית (למשל, מבוססת על [Cl^-] תוך-תאי של 24 מ"מ) כדי לאפשר השוואה עם נתונים אחרים שפורסמו.
7. בצע הקלטות מהדק תיקון של תא שלם כפי שתואר קודם לכן²². אל תכלול תאים מהניתוח אם פוטנציאל הממברנה (V_M) בפריצה הוא יותר מקוטב מ-50 mV, התנגדות הסדרה היא >30 MΩ; או שההתנגדות הסדרתית משתנה ב->20% במהלך ההקלטה. בתנאי הקלטה אלה, התנגדות הסדרה היא בדרך כלל בטווח של 8 - 25 MΩ ויציבה עד שעה.
8. כדי לבחון את הריגוש הפנימי של CA1 מההיפוקמפוס הגבי, בדוק תכונות פיזיולוגיות מהותיות עם רישומי תאים שלמים עם הפרוטוקולים הבאים בתצורת מהדק זרם:
   1. מפוטנציאל הממברנה במנוחה ללא הפעלת זרם הטיה, החל צעדי זרם קטנים (-10 pA, 500 אלפיות השנייה) החוזרים על עצמם 30 פעמים.
   2. מ-70 mV עם זרם הטיה מופעל, החל היפר על שלבי זרם דה-פולריזציה של משך 500 אלפיות השנייה (-100 עד +400 pA, 25 צעדים pA) עם 3 חזרות של משפחת עקבות.
   3. החל גל סינוסואידלי של משרעת שיא לשיא של 100 pA, עם תדר משתנה בין 0.1 ל-20 הרץ. חזור על הפעולה 3 פעמים.
   4. הפעל גירוי של 5x 2 nA, 2 ms כדי להניע פוטנציאל פעולה ב-20, 40, 60, 80, 100 הרץ.
   5. מהדק מתח -70 mV, החל 5 דקות של זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים ספונטניים (EPSC) להקלטה.
9. כדי לאטום מחדש תאים לניתוח היסטולוגי לאחר הקלטה מוצלחת, צור טלאים מבחוץ החוצה על ידי נסיגה איטית של פיפטת התיקון. כאשר נצפית עלייה בהתנגדות הסדרה מרמות ניסוי ל->1 GΩ כפי שנמדד על ידי דופק בדיקה של -5 mV, העלה את פוטנציאל ההחזקה ל-40 mV והחזר את הפיפטה במלואה.
10. בצע הקלטות נוספות באותה פרוסה כדי לספק את העוצמה הסטטיסטית הנדרשת של תכנון הניסוי.
11. הסר פרוסות מוח המכילות נוירונים מוקלטים מתא ההקלטה, הניח בצלחת של 24 בארות, החלף את ה-ACSF ב-4% פרפורמלדהיד (במאגר פוספט של 0.1 M) והשאיר למשך הלילה.
12. למחרת, החלף את ה- PFA במאגר פוספט 0.1 M ואחסן עד לעיבוד היסטולוגי. דמיין תאים עם סטרפטווידין מצומד פלואורסצנטי כפי שתואר קודם לכן²².

הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר הכנת פרוסות ברות קיימא מקוטב המחיצה של ההיפוקמפוס הגבי בחולדות בוגרות. גורם מפתח בפרוטוקול זה הוא זלוף של סוכרוז-ACSF צונן, לפני הכנת הפרוסה, וכתוצאה מכך מחשבי CA1 בריאים קרובים לפני השטח של הפרוסה. איכות הפרוסה המיוצרת מוערכת ויזואלית תחת אופטי?...

כאן, מתואר פרוטוקול להפקת פרוסות מוח באיכות גבוהה מההיקף הגבי של ה-CA1 של ההיפוקמפוס, המאפשר הקלטות ממספר נוירונים ברי קיימא באזור זה. הגישה הקומבינטורית של רישום תאים שלמים מפרוסות כמעט קורונליות ואחריה הדמיית נוירונים היא קריטית לאישור כדאיות התא וזהותו.

המחבר מצהיר שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

המחבר מבקש להודות לפרופ' דיוויד ג'יי איי ווילי, ד"ר אמה פרקינס, לורה סימואס דה אוליביירה ופרופ' פיטר סי קינד על הערותיהם המועילות על כתב היד ואופטימיזציה של הפרוטוקול, וליוזמת סימונס למוח המתפתח על מתן עלויות הפרסום.