DNA'daki nadir nokta mutasyonlarının çıplak gözle tespiti

Bu protokol, altın nanopartiküller ve paramanyetik mikropartiküller kullanarak, 200 kat fazla vahşi tip DNA molekülünde nokta mutasyona uğramış DNA'nın çıplak gözle tanımlanmasına izin verir.

Protokol, aşırı vahşi tip DNA'daki somatik nokta mutasyonlarının tespiti için çıplak gözle kolorimetrik bir testi tanımlar. Yöntemin gelecekte öngörülen uygulaması, sıvı biyopsilerden dolaşımdaki hücresiz DNA'daki nadir mutasyonların tanımlanmasıdır ve kanser teşhisi ve kişiselleştirilmiş tedavi için onkolojik hastaların tabakalandırılmasıyla ilgilidir. Kavramın bir kanıtı olarak test, BRAF genindeki BRAF^V600E mutasyonunu tespit etmek için tasarlanmıştır, bu da BRAF inhibitörleri ile hedefe yönelik tedavilerden fayda sağlayabilecek melanom hastalarının alt grubunu tanımlamak için önemlidir. Bununla birlikte, bu kolorimetrik test, evrensel tespit problarının kullanılması nedeniyle klinik öneme sahip diğer somatik mutasyonlara kolayca genelleştirilebilir ve böylece onkolojik teşhiste güçlü bir potansiyel sağlar.

Test, bazı ticari enstrümantal tahlillerin hassasiyetiyle eşleşen fazla BRAF^WT DNA'da BRAF^V600E'nin% 0,5'ini tespit eder. Bu tür bir duyarlılık, ilaca duyarlı hastaların erken tanımlanmasına izin vererek, tanı amaçları için klinik olarak önemlidir. Gerçek zamanlı PCR'ye dayalı ticari tahlillerin aksine, bu test, standart bir PCR (veya izotermal teknikler) ile amplifiye edilmiş DNA üzerinde gerçekleştirilebildiğinden ve sadece bir saat içinde birkaç adımda tek tüp reaksiyonu ile çıplak gözle okuma sağladığından, minimum enstrümantasyon ve işleme gerektirir. Şu anda, test sadece sentetik DNA örnekleri üzerinde kullanılmıştır. Bununla birlikte, sonuncusu, testin klinik teşhise çevrilmesini desteklemek için dolaşımdaki hücresiz DNA'dan amplifiye edilmiş gerçek bir numuneyi taklit etmek üzere tasarlanmıştır.

Yöntemin amacı, minimal düzeyde aletli bir metodoloji ve çıplak gözle okuma ile bir DNA örneğinde yeterince temsil edilmeyen nokta mutasyonlarını tespit etmektir. Nihai amaç, kanserin erken teşhisi ve izlenmesi için dolaşımdaki hücresiz DNA'daki (ccf-DNA) (örneğin, kan biyopsi örneklerinden) somatik mutasyonların tespiti için hızlı testlerde gelecekteki uygulamalar için uygun bir prensip kanıtı testine sahip olmaktır¹. Kanserle ilişkili somatik mutasyonlar, önemli bir kanser biyobelirteç^2'yi temsil eder ve ccf-DNA'nın küçük (ancak çok değişken)³ bir fraksiyonunda bulunur, bu da tanımlanmalarını zorlaştırır⁴. Model hedef olarak, BRAF kinazın yapısal aktivasyonuna neden olan onkojenik mutasyon BRAF^V600E'yi seçtik. Bu mutasyon, mutasyona uğramış tüm BRAF kanserlerinin %80'inde^{bulunur 5} ve genellikle dolaşımdaki tümör DNA'sının sadece %<1'inde temsil edilir⁶. Bu mutasyonu taşıyan hastaların tanımlanması, BRAF inhibitörlerine terapötik yanıtın öngörücüsü olduğu için önemlidir. Bu nedenle, BRAF mutasyon durumunu değerlendirmek için %^0.01 ile %2 arasında değişen duyarlılıklara sahip çeşitli yöntemler 7,8,9,10 geliştirilmiştir.

Bu yöntemin son teknoloji yöntemlere göre en büyük avantajı, floresan moleküllerinin gerçek zamanlı PCR ile aletli tespitinin aksine, tespitinin aletsiz (çıplak göz) olmasıdır. Diğer bir avantaj, 200'den fazla vahşi tip DNA molekülünde tek bir mutasyona uğramış DNA molekülünü ayırt etmedeki etkinliğidir. %0,5'lik bu ayrım faktörü, enstrümantal bir algılamaya dayalı olarak bazı laboratuvar bazlı veya ticari olarak temin edilebilen kitlerden¹¹ veya¹² ile eşleşir ve bu nedenle klinik tanı uygulamaları ile ilgilidir. Öte yandan, bir laboratuvar prototip testi olarak yöntem, sıcaklığa duyarlı adımların manuel kontrolüne dayanır. Bununla birlikte, testin adım sayısı ve toplam süresi sınırlıdır, bu da otomatik mikroakışkan sistemlerde gelecekteki uygulamasını düşünülebilir hale getirir.

Bu kavram kanıtlama yöntemi, sentetik DNA molekülleri kullanılarak geliştirilmiştir. Kliniklere verimli bir şekilde çevrilmesi için, hastaların kan biyopsilerinden amplifiye edilmiş gerçek dünya örnekleri kullanılarak doğrulanmalıdır. Yöntemin gelecekteki uygulama alanının, vücut sıvıları gibi işlenmemiş karmaşık biyolojik matrislerin doğrudan analizi olmasının amaçlanmadığını not ediyoruz. İkincisinden, DNA'nın standart metodolojilerle ekstrakte edilmesi ve daha sonra çoğaltılması ve saflaştırılması gerekir. Sonuç olarak, analiz için başlangıç materyali her zaman saflaştırılmış ve çoğaltılmış DNA olacaktır, bu da olası enterferans yapan maddeler açısından, bu yöntemin geliştirilmesi için kullanılanlar gibi sentetik bir DNA numunesi ile makul bir şekilde karşılaştırılabilir.

1. Altın nanoparçacık problarının sentezi

1. Aşağıda detaylandırıldığı gibi iki aşamalı standart tohumlama büyüme yöntemini kullanarak 40 nm sitrat başlıklı altın nanopartikülleri sentezleyin.
   1. Klasik Türkevich-Frens yöntemini kullanarak 15 nm sitrat başlıklı altın nanopartikülleri (AuNPs tohumları) sentezleyin^13,14.
      1. Tüm cam eşyaları aqua regia (3:1 v/v oranında HCl:HNO₃ ) ile yıkayın.
      2. 250 mL 0.25 mM HAuCl_4'ü eşit şekilde karıştırarak kaynatın.
         DİKKAT: HAuCl₄ aşındırıcı ve toksiktir.
      3. Hemen 25 mL 38.8 mM Na₃∙sitrat ekleyin.
      4. Çözelti kırmızı yakut rengine dönerken 30 dakika kaynatmaya ve karıştırmaya devam edin.
      5. Çözeltiyi ocaktan alın ve karıştırırken oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
      6. 0,22 μm PTFE membran şırınga filtreleri kullanarak filtreleyin.
      7. 4 °C'de cam şişede saklayın.
         NOT: Deney buradan duraklatılabilir.
   2. Büyümeyi tohumlayarak 40 nm sitrat başlıklı altın nanopartikülleri (40 nm AuNP'ler) sentezleyin¹⁵.
      1. Çözelti A: H₂O'da toplam 120 mL hacimde 13 mL AuNP tohumu ile 390 μL taze hazırlanmış 0.1 M hidroksilamin sülfat hazırlayın.
         NOT: İstenilen boyutu elde etmek için gereken AuNP tohum miktarı değişebilir; her yeni AuNP tohum stoğu için titre edilmelidir.
         DİKKAT: Hidroksilamin sülfat aşındırıcı, toksik, mutajeniktir ve çevre için tehlikelidir. Kullanım için: Kullandıktan sonra iyice yıkayın. Kirlenmiş giysileri çıkarın ve tekrar kullanmadan önce yıkayın. Yeterli havalandırma ile kullanın. Toz oluşumunu ve birikimini en aza indirin. Göz, cilt ve giysilerle temasından kaçının. Kabı sıkıca kapalı tutun. Toz solumaktan kaçının. Metal spatula veya diğer metal parçalarla kullanmayın. Depolama için: Sıkıca kapalı bir kapta saklayın. Serin, kuru ve iyi havalandırılan bir alanda, uyumsuz maddelerden uzakta saklayın. Metallerden uzak tutun.
      2. Çözelti B'yi hazırlayın: 12.25 mL_H2O+ 0.25 mL 0.1 M HAuCl4_.
      3. Çözelti B'yi bir şırıngaya yükleyin ve şırıngayı bir şırınga pompasına yükleyin.
      4. Şırınga pompası parametrelerini ayarlayın: şırınganın mm cinsinden çapı; akış hızı: 90 mL/h; toplam hacim: 10.80 mL (bunun 0.8 mL'si sistem dengelemesi, yani tüp dolumu için gereken fazlalıktır).
      5. Şırınga pompasını çalıştırın. İlk 0.8 mL çözelti B, boruyu doldurduktan ve bir atık kabına bıraktıktan sonra, tüpü çözelti A'yı içeren reaksiyon şişesinin üzerine yerleştirin (orta ve homojen karıştırma altında tutulur) ve çözelti B'nin damla damla girmesine izin verin.
      6. 2.65 mL taze hazırlanmış 0.1 M Na₃∙sitrat ekleyerek kapatın ve 5 dakika karıştırın.
      7. Elde edilen 40 nm AuNP'leri 2,460 x g'da 18 ° C'de 10 dakika santrifüjleyerek konsantre edin.
      8. Süpernatanı nazikçe aspire ederek çıkarın. Kalan hacimde yavaşça yeniden süspansiyon edin.
      9. 4 °C'de saklayın.
         NOT: Deney buradan duraklatılabilir.
2. 40 nm sitrat kapaklı altın nanopartikülleri standart tiyol kimyası¹⁶ ile işlevselleştirin.
   1. Tiyollü prob oligonükleotidlerini (5 ′ T (30) – (O-CH₂–CH₂) ₃–SH 3 ") 10 mM Tris(2-karboksietil) fosfin (TCEP) ile oda sıcaklığında 3 saat hafif çalkalama (400 rpm) altında inkübe ederek disülfid bağını sindirin.
   2. Sindirilmiş oligonükleotidlerin büyük bir kısmını gece boyunca 10 nM AuNP ile, oda sıcaklığında hafif çalkalama (400 rpm) altında inkübe edin.
   3. AuNPs-DNA karışımını, hafif çalkalama (400 rpm) altında, 10 saatlik bir zaman aralığı boyunca kademeli olarak tuz ekleyerek, 10 mM fosfat tamponunda, pH 7.4, %0.01 SDS'de 0.3 M NaCl'ye getirin.
   4. Gece boyunca oda sıcaklığında hafif çalkalama (400 rpm) altında inkübe edin.
   5. Fazla bağlanmamış oligonükleotidleri çıkarmak için DNA ile konjuge AuNP'leri 10 mM fosfat tamponunda 0.25 M NaCl artı %0.01 SDS ile 3 kez yıkayın.
   6. Elde edilen üniversal probları-AuNP'leri kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Deney buradan duraklatılabilir.
   7. Ticari floresan bazlı bir test kullanarak AuNP'ler üzerindeki DNA problarının yoğunluğunu belirleyin
   8. UV-vis spektroskopisi ile AuNP'lerin konsantrasyonunu ölçün. Absorbans verilerinden AuNP konsantrasyonunu elde etmek için, Lambert ve Beer Yasası (A = εbc) ve 40 nm AuNPs¹⁶ için yayınlanan sönme katsayıları kullanılabilir.
   9. AuNP problarını dinamik ışık saçılımı (DLS) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile karakterize edin.
      NOT: Deney buradan duraklatılabilir.

2. BRAF^V600E nadir mutasyonunun kolorimetrik ayrımı

1. Hedef numuneleri analiz için hazırlayın: farklı oranlarda sentetik BRAF^V600E DNA ve BRAF^WT DNA karışımları (BRAF^V600E:BRAF^WT 1:10, 1:100, 1:200, BRAF^V600E %100, BRAF^wt %100).
2. Paramanyetik mikropartikülleri hibridizasyon tamponu (HB) (1x PBS pH 7.4, %5 w/v PEG 600) ile iki kez yıkayarak dengeleyin ve başlangıç hacmine eşit bir HB hacminde yeniden süspanse edin. Yıkama için, 1.5 mL'lik bir tüpe (maksimum 50 μL / tüp) bir miktar paramanyetik mikropartikül koyun, 500 μL HB ekleyin ve hafifçe pipetleyerek üç kez karıştırın, mıknatısı uygulayın, şeffaf süpernatanı ayırın, hemen 500 μL HB ekleyin ve ikinci bir yıkama adımı için prosedürü tekrarlayın. Süpernatanı çıkardıktan sonra, üretici tarafından tavsiye edildiği gibi boncuk kurumasını önlemek için hemen HB'yi ekleyin.
3. Test edilecek her numune için, HB'de 2.5 μL yıkanmış paramanyetik mikropartiküller içeren bir tüp hazırlayın.
4. 2.5 μL paramanyetik mikropartikülleri, BRAF^V600E mutasyonunu barındıran 10 μL'lik bir biyotinile ilk ayırıcı prob (DP1) çözeltisinin 10 μL'si ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe ederek paramanyetik mikropartikülleri işlevselleştirin.
5. Mikropartikülleri enterferans yapan bağlanmamış problardan manyetik olarak ayırın ve bunları 12.5 μL HB içinde yeniden süspanse edin. Bunun için mıknatısı tüpün yan tarafına uygulayın ve çözelti şeffaf olana kadar bekleyin. Solüsyonu dikkatlice pipetleyerek çıkarın, hemen HB ekleyin ve boncuklar homojen bir şekilde yeniden süspanse olana kadar hafifçe pipetleyin.
6. Adım 2.1'de açıklanan DNA hedef örneklerinin 10 μM'lik bir karışımının 10 μL'sini süspansiyona ekleyin.
7. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
8. İnkübasyon sırasında, paramanyetik mikropartiküllerin çökelmesini önlemek için numuneleri her 3 dakikada bir çalkalayın.
9. Süspansiyona, hedefe tamamlayıcı bir kısma ve bir poli-A kuyruğuna sahip olacak şekilde tasarlanmış ikinci bir ayırıcı probun (DP2) 2 μM'lik bir çözeltisinin 10 μL'sini ekleyin.
10. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
11. İnkübasyon sırasında, paramanyetik mikropartiküllerin çökelmesini önlemek için numuneleri her 3 dakikada bir çalkalayın.
12. İnkübasyondan sonra fazla DP2'yi manyetik olarak ayırın.
13. Algılama probları ile konjuge edilmiş 300 fmol AuNP'yi hemen ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
14. Fazla AuNP içeren süpernatanı manyetik olarak ayırın ve oda sıcaklığında 100 μL HB ekleyerek 1^{. yıkama} adımını gerçekleştirin.
15. Süpernatanı manyetik olarak ayırın ve 100 μL HB ekleyerek 2.^{bir yıkama adımı} gerçekleştirin.
16. 52 °C'de 5 dakika inkübe edin.
17. 52 °C'de manyetik olarak ayrılan süpernatant.
18. Kolorimetrik sonucun okunması için hemen 12.5 μL HB'de yeniden süspansiyon haline getirin.
19. Sonuçları fotoğraflayın ve numuneleri 4 °C'de saklayın.

Bu yöntem, aşırı BRAF^wt sentetik DNA'da BRAF^V600E mutasyonunun tespiti için kullanıldı. Şekil 1'de algılama stratejisinin ayrıntıları gösterilmektedir. Tahlil, kolorimetrik bir EVET/HAYIR sonucu^17,18 verir, burada kırmızı pozitif bir sonuca (EVET) ve sarı negatif bir sonuca (HAYIR) karşılık gelir.

Kısaca, streptavidinlenmiş param...

Yöntemin temel yönü, hedef ve hedef olmayan DNA'nın yalnızca tek bir nükleotid için farklılık gösterdiği, müdahale eden hedef olmayan DNA'nın fazlalığı bağlamında bir hedef DNA'yı ayırt etme yeteneğidir. Bu nedenle, probların tasarımı ve hibridizasyon koşulları, hassas bir ayrım elde etmek için kritik öneme sahiptir. Test, ilgilenilen herhangi bir nokta mutasyonunun tespitine uyarlanacak evrensel kolorimetrik probları kullanmak üzere tasarlanmıştır. Bunu...

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Yazarlar, bilimsel ve finansal destek için Profesör Stefano Gustincich'e (Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, IT) minnetle teşekkür eder. Yazarlar ayrıca yararlı bilimsel tartışmalar için Dr. Maurizio Congedo'ya (Vito Fazzi Hastanesi, Lecce, IT) ve Dr. Paolo Tarantino'ya (Vito Fazzi Hastanesi, Lecce, IT) teşekkür eder. Bu çalışma kısmen İtalyan Amiral Gemisi Projesi NanoMax tarafından desteklendi.