DNA 罕见点突变的肉眼检测

该方案允许通过利用金纳米颗粒和顺磁性微粒，在过量 200 倍的野生型 DNA 分子中用肉眼识别点突变 DNA。

该方案描述了一种肉眼比色测试，用于检测过量野生型 DNA 中的体细胞点突变。该方法的未来预期应用是从液体活检中鉴定循环游离 DNA 中的罕见突变，这与癌症诊断和肿瘤患者分层以进行个性化治疗有关。作为概念验证，该测试旨在检测 BRAF 基因中的 BRAF^V600E 突变，这对于确定可以从 BRAF 抑制剂靶向治疗中受益的黑色素瘤患者亚组非常重要。然而，由于使用了通用检测探针，这种比色测试可以很容易地推广到其他具有临床意义的体细胞突变，从而在肿瘤诊断方面提供了强大的潜力。

该检测可检测到 0.5% 的 BRAF^V600E 和过量的 BRAF^WT DNA，这与一些商业仪器检测的灵敏度相匹配。这种敏感性在临床上与诊断目的相关，允许早期识别药物敏感患者。与基于实时 PCR 的商业检测相比，该检测需要最少的仪器和处理，因为它可以对使用标准 PCR（或等温技术）扩增的 DNA 进行，并且只需一小时即可通过几个步骤的单管反应提供肉眼读数。目前，该测试仅用于合成 DNA 样本。然而，后者被设计为模拟从循环游离 DNA 扩增的真实样本，以支持将测试转化为临床诊断。

该方法的目的是使用最少的仪器方法和肉眼读数来检测 DNA 样本中代表性不足的点突变。最终目标是获得一种原理验证检测方法，适用于未来在快速检测中应用，以检测循环游离 DNA （CCF-DNA）（例如，来自血液活检样本）中的体细胞突变，用于癌症的早期诊断和监测¹。癌症相关体细胞突变是一种重要的癌症生物标志物²，存在于 ccf-DNA 的一小部分（但非常可变）³ 中，这使得它们的鉴定具有挑战性⁴。我们选择导致 BRAF 激酶组成型激活的致癌突变 BRAF^V600E 作为模型靶标。这种突变存在于 80% 的 BRAF 突变癌症^{中 5}，通常仅存在于 <1% 的循环肿瘤 DNA^{中 6}。识别携带这种突变的患者很重要，因为它可以预测对 BRAF 抑制剂的治疗反应。因此，已经开发了几种评估 BRAF 突变状态的方法 7,8,9,10，敏感性范围为 0.01% 至 2%。

与最先进的方法相比，该方法的主要优点是无需仪器（肉眼）即可进行检测，而不是通过实时 PCR 对荧光分子进行仪器检测。另一个优点是它能有效地在超过 200 个野生型 DNA 分子中区分单个突变的 DNA 分子。这种 0.5% 的鉴别系数优于¹¹ 或与某些基于实验室或市售的试剂盒相匹配¹² ，基于仪器检测，因此与临床诊断应用相关。另一方面，作为实验室原型测试，该方法依赖于对温度敏感步骤的手动控制。然而，该分析的步骤数量和总持续时间是有限的，这使得它未来在自动化微流控系统中的实施是可以想象的。

这种概念验证方法是使用合成 DNA 分子开发的。为了有效地将其转化为临床，应使用从患者血液活检中扩增的真实样本来验证它。我们注意到该方法的未来应用领域并非旨在直接分析未加工的复杂生物基质，例如体液。从后者中，需要使用标准方法提取 DNA，然后进行扩增和纯化。因此，分析的起始材料始终是纯化和扩增的 DNA，就可能的干扰物质而言，它与合成 DNA 样品（例如用于开发该方法的样品）具有合理的可比性。

1. 金纳米粒子探针的合成

1. 合成 40 nm 柠檬酸盐封端的金纳米颗粒，使用两步标准接种生长方法，如下所述。
   1. 使用经典的 Turkevich-Frens 方法合成 15 nm 柠檬酸盐封端的金纳米颗粒（AuNPs 种子）^13,14。
      1. 用 aqua regia（HCl：HNO_3,3 ：1 v/v 比例）清洗所有玻璃器皿。
      2. 将 250 mL 0.25 mM HAuCl₄ 加热至沸腾，同时均匀搅拌。
         注意：HAuCl₄ 具有腐蚀性和毒性。
      3. 立即加入 25 mL 的 38.8 mM₃ ∙柠檬酸钠。
      4. 继续煮沸并搅拌 30 分钟，同时溶液变成红宝石色。
      5. 将溶液从火上移开，一边搅拌一边冷却至室温。
      6. 使用 0.22 μm PTFE 膜注射器过滤器的过滤器。
      7. 在 4 °C 下储存在玻璃瓶中。
         注意：实验可以在此处暂停。
   2. 通过接种生长合成 40 nm 柠檬酸盐封端的金纳米颗粒 （40 nm AuNPs）¹⁵。
      1. 制备溶液 A：390 μL 新鲜制备的 0.1 M 硫酸羟胺和 13 mL AuNP 种子，在 H₂O 中总体积为 120 mL。
         注意：获得所需大小所需的 AuNPs 种子量可能会有所不同;必须针对每个新的 AuNPs 种子原液进行滴定。
         注意：硫酸羟胺具有腐蚀性、毒性、致突变性，并且对环境有害。处理：处理后彻底清洗。取出受污染的衣物并清洗后再使用。在充分通风的情况下使用。最大限度地减少灰尘的产生和积累。避免接触眼睛、皮肤和衣服。保持容器密闭。避免吸入灰尘。请勿与金属刮刀或其他金属物品一起使用。储存：储存在密闭容器中。存放在阴凉、干燥、通风良好的地方，远离不相容物质。远离金属。
      2. 制备溶液 B：12.25 mL H₂O + 0.25 mL 0.1 M HAuCl₄。
      3. 将溶液 B 装入注射器中，然后将注射器装入注射泵中。
      4. 设置注射泵参数：注射器直径（毫米）;流速：90 mL/h;总体积：10.80 mL（其中 0.8 mL 是系统平衡所需的过量，即试管填充）。
      5. 启动注射泵。在最初的 0.8 mL 溶液 B 填充管中并滴入废液容器中后，将试管放在含有溶液 A 的反应瓶顶部（保持在适度和均匀的搅拌下），让溶液 B 滴入。
      6. 加入 2.65 mL 新鲜制备的 0.1 M₃ ∙柠檬酸钠加盖，搅拌 5 分钟。
      7. 通过在 10 °C 下以 2,460 x g 离心 18 分钟来浓缩获得的 40 nm AuNP。
      8. 轻轻吸出去除上清液。在残留体积中轻轻重悬。
      9. 储存在 4 °C。
         注意：实验可以在此处暂停。
2. 通过标准巯基化学对 40 nm 柠檬酸盐封端的金纳米颗粒进行功能化¹⁶。
   1. 通过在室温下将巯基化探针寡核苷酸 （5' T（30）–（O–CH₂–CH₂）₃–SH 3'） 与 10 mM Tris（2-carboxyethil）膦 （TCEP） 在室温下在轻度摇动 （400 rpm） 下孵育 3 小时来消化二硫键。
   2. 在室温下，在轻度摇动 （400 rpm） 下，将大量过量的消化寡核苷酸与 10 nM AuNP 孵育过夜。
   3. 通过在 10 小时的时间跨度内逐步添加盐，在轻度摇动 （400 rpm） 下，将 AuNPs-DNA 混合物在 10 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4、0.01% SDS）中加入至 0.3 M NaCl。
   4. 在室温下轻轻摇动 （400 rpm） 孵育过夜。
   5. 在 10 mM 磷酸盐缓冲液加 0.01% SDS 中用 0.25 M NaCl 洗涤 DNA 偶联的 AuNP 3 次，以去除过量的未结合寡核苷酸。
   6. 将获得的通用探针-AuNPs储存在4°C直至使用。
      注意：实验可以在此处暂停。
   7. 使用基于荧光的商业测定法测定 AuNP 上 DNA 探针的密度
   8. 通过紫外-可见光谱法测量 AuNP 的浓度。为了从吸光度数据中得出AuNPs浓度，可以使用兰伯特和比尔定律（A=εbc）和公布的40 nm AuNPs¹⁶ 的消光系数。
   9. 通过动态光散射 （DLS） 和透射电子显微镜 （TEM） 表征 AuNPs 探针。
      注意：实验可以在此处暂停。

2. BRAF^V600E 罕见突变的比色判别

1. 制备用于分析的目标样品：不同比例的合成 BRAF^V600E DNA 和 BRAF^WT DNA 的混合物（BRAF^V600E：BRAF^WT 1：10、1：100、1：200、BRAF^V600E 100%、BRAF^wt 100%）。
2. 通过用杂交缓冲液 （HB）（1x PBS pH 7.4,5% w/v PEG 600）洗涤顺磁性微粒两次来平衡顺磁性微粒，并将其重悬于等于起始体积的 HB 体积中。洗涤时，将等分试样的顺磁性微粒放入 1.5 mL 试管（最大 50 μL/管）中，加入 500 μL HB 并轻轻移液混合 3 次，贴上磁铁，分离透明上清液，立即加入 500 μL HB 并重复该程序进行第二次洗涤步骤。去除上清液后，按照制造商的建议，立即加入 HB 以避免珠子干燥。
3. 对于每个待测样品，准备一根管，其中含有 2.5 μL 洗涤的 HB 顺磁性微粒。
4. 通过在室温下将 2.5 μL 顺磁性微粒与 10 μL 10 μM 生物素化第一鉴别探针 （DP1） 溶液孵育 5 分钟，使顺磁性微粒功能化。
5. 将微粒与干扰的未结合探针磁性分离，并将它们重悬于 12.5 μL HB 中。为此，将磁铁施加到管子的侧面，然后等待溶液透明。小心移液去除溶液，立即加入 HB 并轻轻移液，直到珠子均匀地重悬。
6. 向悬浮液中加入 10 μL 10 μM 步骤 2.1 中描述的 DNA 靶标样品混合物。
7. 在室温下孵育 30 分钟。
8. 在孵育过程中，每 3 分钟摇动一次样品，以避免顺磁性微粒沉淀。
9. 向悬浮液中加入 10 μL 的 2 μM 第二鉴别探针 （DP2） 溶液，该探针设计为具有与靶标互补的部分和 poly-A 尾部。
10. 在室温下孵育 15 分钟。
11. 在孵育过程中，每 3 分钟摇动一次样品，以避免顺磁性微粒沉淀。
12. 孵育后磁性分离过量的 DP2。
13. 立即加入 300 fmol 与检测探针偶联的 AuNP，并在室温下孵育 5 分钟。
14. 磁性分离含有过量 AuNP 的上清液，并在室温下加入 100 μL HB 进行^{第 1 个} 洗涤步骤。
15. 磁性分离上清液，并加入 100 μL HB 进行^{第 2 次} 洗涤步骤。
16. 在 52 °C 下孵育 5 分钟。
17. 在 52 °C 下磁性分离上清液。
18. 立即重悬于 12.5 μL HB 中，以获得比色结果的读数。
19. 拍摄结果并将样品储存在 4 °C。

该方法用于检测过量 BRAF^wt 合成 DNA 中的 BRAF^V600E 突变。图 1 显示了检测策略的详细信息。该检测给出比色 YES/NO 结果^17,18，其中红色对应于阳性结果 （YES），黄色对应于阴性结果 （NO）。

简而言之，链霉亲和素化顺磁性微粒包被带有 BRAF^V600E 突变的生物素化鉴?...

该方法的核心方面是能够在干扰非靶标 DNA 过多的情况下区分靶标 DNA，其中靶标 DNA 和非靶标 DNA 仅在一个核苷酸上有所不同。因此，探针的设计和杂交条件对于实现灵敏的区分至关重要。该检测旨在使用通用比色探针，以适应检测任何感兴趣的点突变。然而，每次为新的突变设计新的探针对时，可能必须对反应条件进行一些细微的优化。

该方法中唯...

作者没有什么可披露的。

作者衷心感谢 Stefano Gustincich 教授（意大利热那亚意大利技术学院）提供的科学和财政支持。作者还感谢 Maurizio Congedo 博士（意大利莱切 Vito Fazzi 医院）和 Paolo Tarantino 博士（意大利莱切 Vito Fazzi 医院）进行了有益的科学讨论。这项工作得到了意大利旗舰项目 NanoMax 的部分支持。