Обнаружение невооруженным глазом редких точечных мутаций в ДНК

Этот протокол позволяет невооруженным глазом идентифицировать точечную мутировавшую ДНК в 200-кратном избытке молекул ДНК дикого типа, используя наночастицы золота и парамагнитные микрочастицы.

Протокол описывает колориметрический тест невооруженным глазом для обнаружения соматических точечных мутаций в избытке ДНК дикого типа. В будущем предполагается применение метода для выявления редких мутаций в циркулирующей внеклеточной ДНК из жидких биопсий, что имеет значение для диагностики рака и стратификации онкологических пациентов для персонализированной терапии. В качестве доказательства концепции тест был разработан для обнаружения мутации BRAF^V600E в гене BRAF, что важно для идентификации подгруппы пациентов с меланомой, которые могут извлечь пользу из таргетной терапии ингибиторами BRAF. Тем не менее, этот колориметрический тест может быть легко обобщен на другие соматические мутации, имеющие клиническое значение, благодаря использованию универсальных зондов обнаружения, что обеспечивает большой потенциал в онкологической диагностике.

Тест обнаруживает 0,5% BRAF^V600E в избытке ДНК BRAF^WT , что соответствует чувствительности некоторых коммерческих инструментальных анализов. Такая чувствительность клинически значима для диагностических целей, позволяя раннее выявление пациентов, чувствительных к лекарствам. В отличие от коммерческих анализов, основанных на ПЦР в реальном времени, этот тест требует минимального инструментария и обработки, так как он может быть выполнен на ДНК, амплифицированной с помощью стандартной ПЦР (или изотермических методов), и обеспечивает считывание невооруженным глазом с реакцией в одной пробирке в несколько этапов всего за один час. В настоящее время тест используется только на синтетических образцах ДНК. Тем не менее, последние были разработаны для имитации реального образца, амплифицированного из циркулирующей внеклеточной ДНК, чтобы способствовать переводу теста в клиническую диагностику.

Цель метода заключается в выявлении недостаточно представленных точечных мутаций в образце ДНК с помощью минимально инструментальной методологии и считывания невооруженным глазом. Конечная цель состоит в том, чтобы получить экспериментальный анализ, пригодный для будущих применений в экспресс-тестах для обнаружения соматических мутаций в циркулирующей внеклеточной ДНК (CCF-ДНК) (например, из образцов биопсии крови) для ранней диагностики и^{мониторинга рака.} Соматические мутации, связанные с раком, представляют собой важный биомаркер рака² и присутствуют в незначительной (но очень изменчивой)³ фракции ccf-ДНК, что затрудняет их идентификацию⁴. В качестве модельной мишени мы выбрали онкогенную мутацию BRAF^V600E, которая вызывает конститутивную активацию киназы BRAF. Эта мутация присутствует в 80% всех мутировавших BRAF раковых опухолей5^{и в} целом представлена только в <1% циркулирующей опухолевой ДНК⁶. Выявление пациентов, несущих эту мутацию, важно, поскольку она является прогностическим фактором терапевтического ответа на ингибиторы BRAF. В связи с этим было разработано несколько методов 7,8,9,10 для оценки статуса мутации BRAF с чувствительностью от 0,01% до 2%.

Основное преимущество этого метода перед современными методами заключается в том, что его детектирование является безинструментальным (невооруженным глазом), в отличие от инструментального детектирования флуоресцентных молекул методом ПЦР в реальном времени. Еще одним преимуществом является его эффективность в различении одной мутировавшей молекулы ДНК в более чем 200 молекулах ДНК дикого типа. Этот коэффициент дискриминации в 0,5% превосходит¹¹ или соответствует¹² у некоторых лабораторных или коммерчески доступных наборов, основанных на инструментальном обнаружении, и, таким образом, он актуален для применения в клинической диагностике. С другой стороны, в качестве испытания лабораторного прототипа метод основан на ручном управлении температурно-чувствительными этапами. Тем не менее, количество этапов и общая продолжительность анализа ограничены, что делает возможным его будущее применение в автоматизированных микрофлюидных системах.

Этот метод был разработан с использованием синтетических молекул ДНК. Для эффективного внедрения в клиники он должен быть валидирован с использованием реальных образцов, амплифицированных из биопсии крови пациентов. Отметим, что в будущем область применения метода не предназначена для прямого анализа необработанных сложных биологических матриц, таких как жидкости организма. Из последних ДНК нужно извлечь по стандартным методикам, а затем амплифицировать и очистить. Следовательно, исходным материалом для анализа всегда будет очищенная и амплифицированная ДНК, которая с точки зрения возможных интерферирующих веществ достаточно сопоставима с образцом синтетической ДНК, таким как тот, который использовался для разработки данного метода.

1. Синтез зондов наночастиц золота

1. Синтезируйте наночастицы золота с цитратным покрытием 40 нм, используя двухэтапный стандартный метод посевного роста, как описано ниже.
   1. Синтезировать наночастицы золота с цитратной крышкой 15 нм (семена AuNPs) с использованием классического метода Туркевича–Френса^13,14.
      1. Вымойте всю стеклянную посуду царской водкой (HCl:HNO₃ в соотношении 3:1 об/в).
      2. Нагрейте 250 мл 0,25 мл HAuCl₄ до кипения, равномерно помешивая.
         ВНИМАНИЕ: HAuCl₄ является коррозионным и токсичным.
      3. Немедленно добавьте 25 мл 38,8 мМ Na₃∙цитрата.
      4. Продолжайте кипятить и помешивать в течение 30 минут, пока раствор не приобретет красно-рубиновый цвет.
      5. Снимите раствор с огня и дайте остыть до комнатной температуры, помешивая.
      6. Фильтруйте с помощью мембранных шприцевых фильтров из ПТФЭ 0,22 мкм.
      7. Хранить при температуре 4 °C в стеклянной бутылке.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперимент можно приостановить.
   2. Синтез наночастиц золота с цитратным покрытием 40 нм (40 нм AuNPs) путем посева роста¹⁵.
      1. Приготовьте раствор А: 390 мкл свежеприготовленного 0,1 М гидроксиламина сульфата с 13 мл семян AuNP в общем объеме 120 мл в_Н2О.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Количество семян AuNPs, необходимое для получения желаемого размера, может варьироваться; его необходимо титровать для каждого нового семенного материала AuNPs.
         ВНИМАНИЕ: Гидроксиламина сульфат является коррозионным, токсичным, мутагенным и опасным для окружающей среды. Для обращения: Тщательно вымойте после обращения. Удалите загрязненную одежду и постирайте перед повторным использованием. Используйте при достаточной вентиляции. Сведите к минимуму образование и накопление пыли. Избегайте попадания в глаза, на кожу и в одежду. Держите контейнер плотно закрытым. Избегайте вдыхания пыли. Не используйте с металлическим шпателем или другими металлическими предметами. Для хранения: Хранить в плотно закрытой таре. Хранить в прохладном, сухом, хорошо проветриваемом помещении вдали от несовместимых веществ. Держите подальше от металлов.
      2. Приготовьте раствор В: 12,25 мл H₂O + 0,25 мл 0,1 M HAuCl₄.
      3. Загрузите раствор Б в шприц и загрузите шприц в шприцевой насос.
      4. Установите параметры шприцевого насоса: диаметр шприца в мм; расход: 90 мл/ч; общий объем: 10,80 мл (из которых 0,8 мл – это избыток, необходимый для балансировки системы, т.е. наполнения пробирки).
      5. Запустите шприцевую помпу. После того как первоначальные 0,8 мл раствора В заполнили трубку и высыпаны в контейнер для отходов, поместите пробирку на верхнюю часть реакционной колбы, содержащей раствор А (при умеренном и равномерном перемешивании) и дайте раствору В войти по каплям.
      6. Закройте крышкой, добавив 2,65 мл свежеприготовленного 0,1 М Na₃∙цитрата, и перемешивайте в течение 5 минут.
      7. Концентрируют полученные 40 нм AuNP путем центрифугирования при 2460 x g в течение 18 мин при 10 °C.
      8. Удалите надосадочную жидкость с помощью легкой аспирации. Аккуратно суспендируйте в остаточном объеме.
      9. Хранить при температуре 4 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперимент можно приостановить.
2. Функционализация наночастиц золота с цитратным покрытием 40 нм стандартным тиоловым химическим^{составом 16}.
   1. Дисульфидную связь расщепляют путем инкубации тиолированных зондовых олигонуклеотидов (5', T(30)–(O–CH,₂–CH,₂)₃–SH, 3') с 10 мМ трис(2-карбоксиетил)фосфином (TCEP) при комнатной температуре в течение 3 ч при слабом встряхивании (400 об/мин).
   2. Инкубируйте большой избыток переваренных олигонуклеотидов в течение ночи с 10 нМ AuNPs при комнатной температуре при слабом встряхивании (400 об/мин).
   3. Доведите смесь AuNPs-ДНК до 0,3 М NaCl в 10 мМ фосфатном буфере, pH 7,4, 0,01% SDS, добавляя соль поэтапно в течение 10 часов, при слабом встряхивании (400 об/мин).
   4. Инкубировать в течение ночи при комнатной температуре при слабом встряхивании (400 об/мин).
   5. Промойте ДНК-конъюгированные AuNP 3 раза 0,25 М NaCl в 10 мМ фосфатном буфере плюс 0,01% SDS, чтобы удалить избыток несвязанных олигонуклеотидов.
   6. Полученные универсальные щупы-AuNP хранят при температуре 4 °C до начала использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперимент можно приостановить.
   7. Определение плотности зондов ДНК на AuNP с помощью коммерческого флуоресцентного анализа
   8. Измерьте концентрацию AuNP с помощью УФ-видимой спектроскопии. Для того, чтобы получить концентрацию AuNPs на основе данных об абсорбции, можно использовать закон Ламберта и Бира (A=εbc) и опубликованные коэффициенты экстинкции для 40 нм AuNPs¹⁶ .
   9. Определение характеристик зондов AuNPs с помощью динамического рассеяния света (DLS) и просвечивающей электронной микроскопии (TEM).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперимент можно приостановить.

2. Колориметрическая дискриминация редкой мутации BRAF^V600E

1. Подготовьте для анализа целевые образцы: смеси синтетической ДНК BRAF^V600E и BRAF^WT ДНК в различных соотношениях (BRAF^V600E:BRAF^WT 1:10, 1:100, 1:200, BRAF^V600E 100%, BRAF^wt 100%).
2. Уравновесьте парамагнитные микрочастицы, дважды промыв их гибридизационным буфером (HB) (1x PBS pH 7,4, 5% w/v PEG 600) и ресуспендируйте их в объеме HB, равном исходному объему. Для промывания поместите аликвоту парамагнитных микрочастиц в пробирку объемом 1,5 мл (максимум 50 мкл/тубу), добавьте 500 мкл HB и трижды перемешайте с помощью осторожного пипетирования, приложите магнит, отделите прозрачную надосадочную жидкость, сразу же добавьте 500 мкл HB и повторите процедуру для второго этапа промывки. После удаления надосадочной жидкости немедленно добавьте НВ, чтобы избежать высыхания валиков, как рекомендует производитель.
3. Для каждого тестируемого образца подготовьте пробирку, содержащую 2,5 мкл отмытых парамагнитных микрочастиц в HB.
4. Функционализация парамагнитных микрочастиц путем инкубации 2,5 мкл парамагнитных микрочастиц с 10 мкл 10 мкМ раствора биотинилированного первого дискриминирующего зонда (DP1), содержащего мутацию BRAF^V600E , в течение 5 мин при комнатной температуре.
5. Магнитное отделение микрочастиц от мешающих несвязанных зондов и их ресуспендирование в 12,5 мкл HB. Для этого приложите магнит к боковой стороне трубки и подождите, пока раствор не станет прозрачным. Удалите раствор путем тщательного пипетирования, немедленно добавьте HB и аккуратно пипетируйте до тех пор, пока шарики не станут однородно ресуспендированными.
6. Добавьте в суспензию 10 мкл смеси 10 мкМ образцов ДНК-мишени, описанных на шаге 2.1.
7. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре.
8. Во время инкубации каждые 3 минуты встряхивайте образцы, чтобы избежать осаждения парамагнитных микрочастиц.
9. Добавьте в суспензию 10 мкл 2 мкМ раствора второго дискриминирующего зонда (DP2), сконструированного таким образом, чтобы иметь часть, комплементарную мишени, и поли-А хвост.
10. Выдерживать 15 минут при комнатной температуре.
11. Во время инкубации каждые 3 минуты встряхивайте образцы, чтобы избежать осаждения парамагнитных микрочастиц.
12. После инкубации избыток DP2 отделить с помощью магнита.
13. Немедленно добавьте 300 фмоль AuNP, конъюгированных с детектирующими зондами, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут.
14. Магнитно отделите надосадочную жидкость, содержащую избыток AuNP, и выполните^1-ю стадию стирки, добавив 100 мкл HB при комнатной температуре.
15. Отделите надосадочную жидкость с помощью магнитов и выполните^2-ю стадию стирки, добавив 100 мкл HB.
16. Выдерживать при температуре 52 °C в течение 5 минут.
17. Магнитно раздельный надосадочный кондуктор при 52 °C.
18. Немедленно суспендируйте в 12,5 мкл HB для считывания колориметрического результата.
19. Сфотографируйте результаты и храните образцы при температуре 4 °C.

Этот метод был использован для выявления мутации BRAF^V600E в избытке^{синтетической} ДНК BRAF. На рисунке 1 показаны детали стратегии обнаружения. Анализ дает колориметрический результат ДА/НЕТ^17,18, где красный цвет с?...

Ключевым аспектом метода является способность различать целевую ДНК в контексте избытка интерферирующей нецелевой ДНК, где целевая и нецелевая ДНК различаются только для одного нуклеотида. Таким образом, конструкция зондов и условия гибридизации имеют решающее зна...

Авторам нечего раскрывать.

Авторы выражают благодарность профессору Стефано Густинчичу (Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, IT) за научную и финансовую поддержку. Авторы также выражают признательность доктору Маурицио Конгедо (больница Вито Фацци, Лечче, Италия) и доктору Паоло Тарантино (больница Вито Фацци, Лечче, Италия) за полезные научные дискуссии. Эта работа была частично поддержана итальянским флагманским проектом NanoMax.