Rilevamento ad occhio nudo di rare mutazioni puntiformi nel DNA

Questo protocollo consente l'identificazione ad occhio nudo di DNA puntiforme mutato in un eccesso di 200 volte di molecole di DNA wild type, sfruttando nanoparticelle d'oro e microparticelle paramagnetiche.

Il protocollo descrive un test colorimetrico ad occhio nudo per la rilevazione di mutazioni puntiformi somatiche in un eccesso di DNA wild type. L'applicazione futura prevista del metodo è l'identificazione di mutazioni rare nel DNA libero da cellule circolanti da biopsie liquide, con una rilevanza nella diagnostica del cancro e nella stratificazione dei pazienti oncologici per la terapia personalizzata. Come prova di concetto, il test è stato progettato per rilevare la mutazione BRAF^V600E nel gene BRAF, che è importante per identificare il sottogruppo di pazienti con melanoma che possono beneficiare di terapie mirate con inibitori di BRAF. Tuttavia, questo test colorimetrico può essere facilmente generalizzato ad altre mutazioni somatiche di rilevanza clinica grazie all'uso di sonde di rilevamento universali, fornendo così un forte potenziale nella diagnostica oncologica.

Il test rileva lo 0,5% di BRAF^V600E in un eccesso di BRAF^WT DNA, che corrisponde alla sensibilità di alcuni test strumentali commerciali. Tale sensibilità è clinicamente rilevante per scopi diagnostici, consentendo l'identificazione precoce dei pazienti sensibili ai farmaci. A differenza dei test commerciali basati sulla PCR in tempo reale, questo test richiede una strumentazione e un'elaborazione minime, in quanto può essere eseguito su DNA amplificato con una PCR standard (o tecniche isotermiche) e fornisce una lettura ad occhio nudo con una reazione in una provetta di pochi passaggi in una sola ora. Attualmente, il test è stato utilizzato solo su campioni di DNA sintetico. Tuttavia, questi ultimi sono stati progettati per imitare un campione reale amplificato dal DNA libero circolante, per favorire la traduzione del test in diagnostica clinica.

Lo scopo del metodo è quello di rilevare mutazioni puntiformi sottorappresentate in un campione di DNA con una metodologia minimamente strumentata e una lettura ad occhio nudo. L'obiettivo finale è quello di disporre di un test proof-of-principle, adatto per future applicazioni in test rapidi per la rilevazione di mutazioni somatiche nel DNA libero da cellule circolanti (ccf-DNA) (ad esempio, da campioni di biopsia del sangue) per la diagnosi precoce e il monitoraggio del cancro¹. Le mutazioni somatiche correlate al cancro rappresentano un importante biomarcatore tumorale² e sono presenti in una frazione minore (ma molto variabile)³ di ccf-DNA, rendendo difficile la loro identificazione⁴. Abbiamo scelto, come bersaglio modello, la mutazione oncogenica BRAF^V600E che causa l'attivazione costitutiva della chinasi BRAF. Questa mutazione è presente nell'80% di tutti i tumori con mutazione BRAF⁵ ed è generalmente rappresentata solo nell'<1%^{del DNA} tumorale 6 circolante. L'identificazione dei pazienti portatori di questa mutazione è importante in quanto è predittiva della risposta terapeutica agli inibitori di BRAF. Pertanto, sono stati sviluppati diversi metodi 7,8,9,10 per valutare lo stato di mutazione di BRAF, con sensibilità comprese tra lo 0,01% e il 2%.

Il vantaggio principale di questo metodo rispetto ai metodi all'avanguardia è che la sua rilevazione è priva di strumenti (occhio nudo), al contrario della rilevazione strumentale di molecole fluorescenti mediante PCR in tempo reale. Un altro vantaggio è la sua efficienza nel discriminare una singola molecola di DNA mutata in un eccesso di 200 molecole di DNA wild type. Questo fattore di discriminazione dello 0,5% è superiore a¹¹ o corrisponde a¹² a quello di alcuni kit di laboratorio o disponibili in commercio, basati su un rilevamento strumentale ed è, quindi, rilevante per le applicazioni diagnostiche cliniche. D'altra parte, come test di prototipo di laboratorio, il metodo si basa sul controllo manuale dei passaggi sensibili alla temperatura. Tuttavia, il numero di passaggi e la durata totale del test sono limitati, rendendo concepibile la sua futura implementazione in sistemi microfluidici automatizzati.

Questo metodo proof-of-concept è stato sviluppato utilizzando molecole di DNA sintetico. Per la sua traduzione efficiente nelle cliniche, dovrebbe essere convalidato utilizzando campioni del mondo reale amplificati dalle biopsie del sangue dei pazienti. Notiamo che il futuro campo di applicazione del metodo non è destinato ad essere l'analisi diretta di matrici biologiche complesse non trattate, come i fluidi corporei. Da quest'ultimo, il DNA deve essere estratto con metodologie standard, per poi essere amplificato e purificato. Di conseguenza, la materia di partenza per l'analisi sarà sempre il DNA purificato e amplificato, che è ragionevolmente paragonabile, in termini di possibili sostanze interferenti, a un campione di DNA sintetico, come quello utilizzato per lo sviluppo di questo metodo.

1. Sintesi di sonde di nanoparticelle d'oro

1. Sintetizzare nanoparticelle d'oro ricoperte di citrato da 40 nm, utilizzando il metodo di crescita della semina standard in due fasi come descritto di seguito.
   1. Sintetizzare nanoparticelle d'oro ricoperte di citrato da 15 nm (semi di AuNPs) utilizzando il classico metodo Turkevich-Frens^13,14.
      1. Lavare tutta la vetreria con acqua regia (HCl:HNO₃ in rapporto 3:1 v/v).
      2. Scaldare 250 ml di 0,25 mM di HAuCl₄ per far bollire mescolando uniformemente.
         ATTENZIONE: HAuCl₄ è corrosivo e tossico.
      3. Aggiungere immediatamente 25 mL di 38,8 mM di Na₃∙citrato.
      4. Continuate a bollire e mescolate per 30 minuti, mentre la soluzione assume un colore rosso rubino.
      5. Togliete la soluzione dal fuoco e lasciate raffreddare a temperatura ambiente mescolando.
      6. Filtrare utilizzando filtri per siringa a membrana in PTFE da 0,22 μm.
      7. Conservare a 4 °C in bottiglia di vetro.
         NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui.
   2. Sintetizzare nanoparticelle d'oro ricoperte di citrato da 40 nm (AuNP da 40 nm) seminando la crescita¹⁵.
      1. Preparare la soluzione A: 390 μL di idrossilammina solfato 0,1 M appena preparato con 13 mL di semi AuNP in un volume totale di 120 mL in H₂O.
         NOTA: La quantità di semi di AuNPs necessaria per ottenere la dimensione desiderata può variare; deve essere titolato per ogni nuovo stock di semi di AuNPs.
         ATTENZIONE: L'idrossilammina solfato è corrosivo, tossico, mutageno e pericoloso per l'ambiente. Per la manipolazione: Lavare accuratamente dopo la manipolazione. Rimuovere gli indumenti contaminati e lavarli prima di riutilizzarli. Utilizzare con un'adeguata ventilazione. Ridurre al minimo la generazione e l'accumulo di polvere. Evitare il contatto con occhi, pelle e indumenti. Tenere il contenitore ben chiuso. Evitare di respirare la polvere. Non utilizzare con spatole metalliche o altri oggetti metallici. Per la conservazione: Conservare in un contenitore ben chiuso. Conservare in luogo fresco, asciutto e ben ventilato, lontano da sostanze incompatibili. Tenere lontano dai metalli.
      2. Preparare la soluzione B: 12,25 mL di H₂O + 0,25 mL di 0,1 M HAuCl₄.
      3. Caricare la soluzione B in una siringa e caricare la siringa in una pompa a siringa.
      4. Impostare i parametri della pompa a siringa: diametro della siringa in mm; portata: 90 mL/h; volume totale: 10,80 mL (di cui, 0,8 mL sono l'eccesso necessario per l'equilibrio del sistema, cioè il riempimento del tubo).
      5. Avviare la pompa a siringa. Dopo che i primi 0,8 mL di soluzione B hanno riempito il tubo e lo hanno lasciato cadere in un contenitore di scarto, posizionare il tubo sopra il pallone di reazione contenente la soluzione A (tenuto sotto agitazione moderata e uniforme) e lasciare che la soluzione B entri goccia a goccia.
      6. Tappare aggiungendo 2,65 mL di 0,1 M Na₃∙citrato appena preparato e mescolare per 5 minuti.
      7. Concentrare gli AuNP ottenuti a 40 nm centrifugando a 2,460 x g per 18 min a 10 °C.
      8. Rimuovere il surnatante aspirando delicatamente. Risospendere delicatamente nel volume residuo.
      9. Conservare a 4 °C.
         NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui.
2. Funzionalizzare nanoparticelle d'oro ricoperte di citrato da 40 nm mediante chimica tiolica standard¹⁶.
   1. Digerire il legame disolfuro incubando oligonucleotidi sonda tiolati (5′ T(30)–(O–CH₂–CH₂)₃–SH 3′) con 10 mM di Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) a temperatura ambiente per 3 ore sotto lieve agitazione (400 giri/min).
   2. Incubare un grande eccesso di oligonucleotidi digeriti durante la notte con 10 nM di AuNPs, a temperatura ambiente sotto leggero agitamento (400 rpm).
   3. Portare la miscela AuNPs-DNA a 0,3 M di NaCl in 10 mM di tampone fosfato, pH 7,4, 0,01% SDS, aggiungendo sale gradualmente in un intervallo di tempo di 10 ore, agitando leggermente (400 giri/min).
   4. Incubare per una notte a temperatura ambiente con un leggero agitamento (400 giri/min).
   5. Lavare le AuNP coniugate con DNA 3 volte con NaCl 0,25 M in tampone fosfato 10 mM più SDS allo 0,01%, per rimuovere gli oligonucleotidi non legati in eccesso.
   6. Conservare le sonde universali-AuNP ottenute a 4 °C fino all'uso.
      NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui.
   7. Determinare la densità delle sonde di DNA sulle AuNP utilizzando un saggio commerciale basato sulla fluorescenza
   8. Misurare la concentrazione di AuNP mediante spettroscopia UV-vis. Al fine di derivare la concentrazione di AuNPs dai dati di assorbanza, possono essere utilizzati la legge di Lambert & Beer (A = εbc) e i coefficienti di estinzione pubblicati per 40 nm AuNPs¹⁶ .
   9. Caratterizzazione delle sonde AuNPs mediante diffusione dinamica della luce (DLS) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
      NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui.

2. Discriminazione colorimetrica della mutazione rara di BRAF^V600E

1. Preparare i campioni target per l'analisi: miscele di DNA sintetico BRAF^V600E e BRAF^WT DNA in diversi rapporti (BRAF^V600E:BRAF^WT 1:10, 1:100, 1:200, BRAF^V600E 100%, BRAF^wt 100%).
2. Equilibrare le microparticelle paramagnetiche lavandole due volte con tampone di ibridazione (HB) (1x PBS pH 7,4, 5% p/v PEG 600) e risospenderle in un volume di HB pari al volume di partenza. Per il lavaggio, mettere un'aliquota di microparticelle paramagnetiche in una provetta da 1,5 mL (massimo 50 μL/provetta), aggiungere 500 μL di HB e mescolare tre volte pipettando delicatamente, applicare il magnete, separare il surnatante trasparente, aggiungere immediatamente 500 μL di HB e ripetere la procedura per una seconda fase di lavaggio. Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere immediatamente l'HB per evitare l'essiccazione delle perline, come consigliato dal produttore.
3. Per ogni campione da analizzare, preparare una provetta contenente 2,5 μl di microparticelle paramagnetiche lavate in HB.
4. Funzionalizzare le microparticelle paramagnetiche incubando 2,5 μL di microparticelle paramagnetiche con 10 μL di una soluzione da 10 μM di una prima sonda discriminante biotinilata (DP1), contenente la mutazione BRAF^V600E , per 5 minuti a temperatura ambiente.
5. Separare magneticamente le microparticelle dalle sonde non legate interferenti e risospenderle in 12,5 μL di HB. A tal fine, applicare il magnete sul lato del tubo e attendere che la soluzione sia trasparente. Rimuovere la soluzione pipettando accuratamente, aggiungere immediatamente HB e pipettare delicatamente fino a quando le perle non sono risospese in modo omogeneo.
6. Aggiungere alla sospensione 10 μl di una miscela da 10 μM dei campioni bersaglio di DNA descritti al punto 2.1.
7. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
8. Durante l'incubazione, agitare i campioni ogni 3 minuti per evitare la sedimentazione delle microparticelle paramagnetiche.
9. Aggiungere alla sospensione 10 μL di una soluzione da 2 μM di una seconda sonda discriminante (DP2), progettata per avere una porzione complementare al bersaglio e una coda in poli-A.
10. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
11. Durante l'incubazione, agitare i campioni ogni 3 minuti per evitare la sedimentazione delle microparticelle paramagnetiche.
12. Separare magneticamente l'eccesso di DP2 dopo l'incubazione.
13. Aggiungere immediatamente 300 fmol di AuNP coniugate con sonde di rilevamento e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
14. Separare magneticamente il surnatante contenente AuNP in eccesso ed eseguire la prima fase^{di lavaggio aggiungendo} 100 μL di HB a temperatura ambiente.
15. Separare magneticamente il surnatante ed eseguire una seconda fase^{di lavaggio aggiungendo} 100 μl di HB.
16. Incubare a 52 °C per 5 min.
17. Surnatante separato magneticamente a 52 °C.
18. Risospendere immediatamente in 12,5 μL di HB per la lettura del risultato colorimetrico.
19. Fotografare i risultati e conservare i campioni a 4 °C.

Questo metodo è stato utilizzato per la rilevazione della mutazione BRAF^V600E in un eccesso di DNA sintetico BRAF^wt. Nella Figura 1 vengono illustrati i dettagli della strategia di rilevamento. Il test dà un risultato colorimetrico SI/NO^17,18 dove il rosso corrisponde a un risultato positivo (YES) e il giallo a uno negativo (NO).

In breve, le microp...

L'aspetto centrale del metodo è la capacità di discriminare un DNA bersaglio nel contesto di un eccesso di DNA non bersaglio interferente, dove il DNA bersaglio e non bersaglio differiscono solo per un singolo nucleotide. Pertanto, la progettazione delle sonde e le condizioni di ibridazione sono fondamentali per ottenere una discriminazione sensibile. Il test è progettato per utilizzare sonde colorimetriche universali per essere adattato alla rilevazione di eventuali mutazioni puntifo...

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli autori ringraziano il professor Stefano Gustincich (Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, IT) per il supporto scientifico e finanziario. Gli autori ringraziano inoltre il Dott. Maurizio Congedo (Ospedale Vito Fazzi, Lecce, IT) e il Dott. Paolo Tarantino (Ospedale Vito Fazzi, Lecce, IT) per le utili discussioni scientifiche. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal progetto di punta italiano NanoMax.