11.22 : Moleküler Eleme Kromatografisi

Moleküler eleme kromatografisinde (SEC), moleküller boyutlarına göre ayrılır; bu yöntem aynı zamanda moleküler dışlama veya jel geçirgenlik kromatografisi olarak da bilinir. Bu teknik, polimerler ve biyomoleküller gibi büyük moleküllerin ayrılmasında önemlidir. SEC'de karşılaşılan mikron boyutundaki durağan fazlar, silika partikülleri ve çapraz bağlı polimer reçine boncuklarıdır. Her iki malzeme de gözeneklidir, ancak gözenek boyutları önemli ölçüde farklılık gösterir.

Silika partikülleri, sertlik, kararlılık ve çeşitli çözücülerle uyumluluk gibi avantajlar sunar. Buna karşılık, polimer boncukları farklı gözenek boyutlarında olup, hidrofilik (su seven) veya hidrofobik (su sevmeyen) olabilir. Agar ve poliakrilamid gibi hidrofilik jeller sulu ayrımlar için kullanılırken, polistiren-divinilbenzen gibi hidrofobik jeller, polar olmayan çözücüler için tercih edilir. Boyut ayırma için kullanılan silika partikülleri, istenmeyen etkileşimleri önlemek amacıyla pasifleştirilirken, polimer reçineler iyon değişim bölgeleri olmadan sentezlenir.

Daha küçük çözücüler, durağan fazın gözeneklerinde daha fazla zaman geçirir, bu da kolon içinden daha uzun bir elüsyon süresiyle sonuçlanır. Bir çözücünün tutunma hacmi, dağılım oranına bağlıdır; bu oran dışlama sınırında 0'dan, dahil olma sınırında ise 1'e kadar değişir. Bu, çözücünün gözeneklere ne kadar iyi nüfuz ettiğini yansıtır.

SEC, protein karışımlarının analizi ve formül ağırlıklarının belirlenmesinde dikkat çeken bir uygulamadır. Dışlama ve dahil olma sınırları arasında kalibrasyon eğrileri hazırlanabilir, ancak doğru formül ağırlığı tayinleri, şekil etkisini en aza indirmek için dikkatle seçilmiş standartlar gerektirir.

Bu teknik, geleneksel HPLC ekipmanları kullanılarak, HPLC kolonunun uygun bir boyut ayırma kolonu ile değiştirilmesiyle gerçekleştirilebilir. Kromatogramları elde etmek için genellikle bir UV/Vis dedektörü kullanılır.