11.22 : كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي

في كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي (SEC)، والمعروفة أيضًا باسم كروماتوغرافيا الاستبعاد الجزيئي أو كروماتوغرافيا نفاذية الهلام، يتم فصل الجزيئات بناءً على أحجامها. هذه التقنية مهمة لفصل الجزيئات الكبيرة مثل البوليمرات والجزيئات الحيوية. الفئتان الرئيسيتان من المراحل الثابتة بحجم الميكرون المستخدمة في الـ SEC هما جزيئات السيليكا وحبيبات راتنج البوليمر المترابطة. كلتا المادتين مساميتان، لكن أحجام مسامهما تختلف بشكل كبير.

توفر جزيئات السيليكا مزايا مثل الصلابة والاستقرار والتوافق مع المذيبات المختلفة. على النقيض من ذلك، تأتي حبيبات البوليمر بأحجام مسام متنوعة ويمكن أن تكون محبة للماء أو كارهة للماء. تُستخدم المواد الهلامية المحبة للماء مثل الأجار والبولي أكريلاميد للفصل في الأوساط المائية، بينما تُفضل المواد الهلامية الكارهة للماء مثل البوليسترين ديفينيل بنزين للمذيبات غير القطبية. يتم تعطيل جزيئات السيليكا المستخدمة في استبعاد الحجم لمنع التفاعلات غير المرغوب فيها، بينما يتم تصنيع راتنجات البوليمر بدون مواقع تبادل.

تقضي المواد المذابة الأصغر وقتًا أطول داخل مسام الطور الثابت، مما يؤدي إلى وقت إفلات أطول من العمود. يعتمد حجم الاحتفاظ بالمذاب على نسبة توزيعه، والتي تتراوح من 0 عند حد الاستبعاد إلى 1 عند حد التضمين. يعكس هذا مدى قدرة المذاب على اختراق المسام.

يُعد الـ SEC تطبيقًا بارزًا في تحليل مخاليط البروتين وتحديد أوزان الصيغة. يمكن إعداد منحنيات المعايرة بين حدود الاستبعاد والتضمين، لكن تحديد وزن الصيغة بدقة يتطلب معايير مختارة بعناية لتقليل تأثير الشكل.

يمكن تنفيذ هذه التقنية باستخدام أجهزة HPLC التقليدية عن طريق استبدال عمود HPLC بعمود استبعاد حجم مناسب. يستخدم كاشف الأشعة فوق البنفسجية/المرئية عادةً للحصول على مخططات الكروماتوغرام.