11.22 : Cromatografia ad esclusione dimensionale

Nella cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), nota anche come cromatografia ad esclusione molecolare o a permeazione di gel, le molecole vengono separate in base alle loro dimensioni. Questa tecnica è importante per separare le molecole di grandi dimensioni come i polimeri e le biomolecole. Le due classi di fasi stazionarie di dimensioni micrometriche riscontrate nella SEC sono delle particelle di silice e perle di resina polimerica reticolata. Entrambi i materiali sono porosi, ma le dimensioni dei loro pori variano in modo significativo.

Le particelle di silice offrono dei vantaggi come la rigidità, la stabilità e la compatibilità con i vari solventi. Al contrario, le perle di polimero hanno dei pori di diverse dimensioni e possono essere idrofile (che amano l'acqua) o idrofobe (che respingono l'acqua). I gel idrofili come l’agar e il poliacrilammide vengono usati per le separazioni acquose, mentre i gel idrofobi, come il polistirene-divinilbenzene sono preferiti per i solventi non polari. Le particelle di silice usate per l'esclusione dimensionale vengono disattivate per evitare di avere interazioni indesiderate, mentre le resine polimeriche vengono sintetizzate senza i siti di scambio.

I soluti più piccoli trascorrono più tempo nei pori della fase stazionaria, con un conseguente tempo di eluizione più lungo dalla colonna. Il volume di ritenzione per un soluto dipende dal suo rapporto di distribuzione, che varia da 0 al limite di esclusione a 1 al limite di inclusione. Questo riflette quanto bene il soluto penetra nei pori.

La SEC è un'applicazione notevole nell'analisi delle miscele proteiche e nella determinazione dei pesi formula. Le curve di calibrazione possono essere preparate tra i limiti di esclusione e d’inclusione, ma le determinazioni accurate del peso formula richiedono degli standard scelti attentamente per ridurre al minimo l'effetto della forma.

Questa tecnica può essere eseguita usando la strumentazione HPLC convenzionale sostituendo la colonna HPLC con una colonna di esclusione dimensionale appropriata. Di solito, per ottenere i cromatogrammi viene usato un rilevatore UV/Vis.