Этот протокол показывает соответствующую методологию для нарезки и окрашивания тканей сердца и мозга. В нем также содержатся рекомендации по установке освещения и камеры, а также методы фотосъемки для получения изображений. Эти методы особенно полезны для выполнения измерений при планиметрическом анализе изображений в тканях грызунов и могут представлять ценность для общенаучной макрофотографии.
Для начала отсоедините сердечную канюлю от шприца, заполненного раствором Кребса-Генселеита и подключенного к шприцу, заполненному теплым раствором Кребса-Генселеита, содержащим 0,1% метиленового синего. Перфузируйте сердце крысы четырьмя миллилитрами раствора метиленового синего со скоростью четыре миллилитра в минуту. После отсоединения канюли от шприца и удаления сердца из канюли удалите избыток метиленового синего, аккуратно раскатывая сердце на папиросной бумаге.
После удаления избытка метиленового синего ослабьте лигатуру вокруг коронарной артерии, открыв гемостатические щипцы и удалив пластиковую трубку вокруг хирургического шва. Затем поместите окрашенное сердце крысы в матрицу из нержавеющей стали для нарезки. Разрежьте желудочки на ломтики толщиной в два миллиметра, стремясь получить шесть-семь ломтиков от одного сердца взрослой крысы.
После нарезки переложите ломтики в 15-миллилитровую пластиковую трубку. Затем добавить пять миллилитров 1%-трифенилтетразолия хлорида, растворенного в PBS, в трубку с сердечными ломтиками и инкубировать в течение 10 минут на водяной бане при 37 градусах Цельсия с мягким перемешиванием через пять минут. После инкубации промыть кусочки сердца не менее двух-трех раз PBS и подготовиться к захвату изображения.
После удаления мозга, включая ствол мозга, из черепа поместите мозг с его вентральной стороной вверх в матрицу мозга. В зависимости от веса животных, выбирайте правильный размер мозговой матрицы из нержавеющей стали. Используя лопасти, ограничьте лобную и каудальную части мозга.
Затем поместите лопасти частично в каналы между первым и последним лезвиями. Когда все лезвия вставлены и расположены параллельно, прижмите все лезвия ладонью одновременно, чтобы разрезать мозг на двухмиллиметровые корональные срезы. Затем двумя пальцами крепко обхватите лезвия по бокам и извлеките их вместе с разрезанным мозгом из матрицы.
Расположите кусочки мозга один за другим в лотке, гарантируя, что внутренняя поверхность каждого среза всегда обращена вверх. Затем вылейте теплый 1% раствор трифенилтетразолия хлорида и PBS на ломтики мозга и инкубируйте в течение восьми минут при 37 градусах Цельсия в темноте. После инкубации переместите кусочки мозга в синий пластиковый лоток для захвата изображений.
Расположите срезы мозга в последовательном порядке от лобной к каудальной части и используйте скальпель для разделения полушарий в сагиттальной плоскости. Сфотографируйте срезы ткани сразу после окрашивания. Установите камеру по своему выбору с заряженной батареей, картой памяти и прикрепленным объективом на подставке.
В зависимости от доступных источников света выберите соответствующие настройки баланса белого или выполните калибровку цветовой температуры в соответствии с инструкциями в руководстве по эксплуатации камеры. Полностью погрузите сердечные срезы в контейнер с PBS. Разложите ломтики мозга в сухом лотке без PBS или других жидкостей.
Поместите контейнер с срезами под камеру с макрообъективом. Убедитесь, что все фрагменты полностью помещаются в поле зрения и находятся на одной плоскости. Переключите камеру в полностью ручной режим, установите ISO 100 и диафрагму на F10.
Отрегулируйте выдержку для оптимальной экспозиции изображения и убедитесь, что фокальная плоскость камеры параллельна поверхности, где находится образец. После захвата номера образца поверните круговой поляризационный фильтр до тех пор, пока не исчезнут отражения, и визуализируйте срез ткани с помощью дистанционного триггера, чтобы предотвратить дрожание камеры при отпускании затвора, затем поверните срезы и захватите изображения с другой стороны. Эта фотография среза сердца, окрашенного метиленовым синим и трифенилтетразолием хлоридом после инфаркта миокарда, содержит достаточно подробной и цветовой информации для дальнейшего планиметрического анализа размеров инфаркта.
Замораживание сердечной ткани в течение 24 часов влияет на целостность и снижает митохондриальную функцию. Таким образом, трифенилтетразолийхлоридное окрашивание сердца не красный, а бледно-розовый, а граница между некротическими и жизнеспособными тканями размыта. Из двух методов, сравниваемых для уменьшения отражений в образцах, погружение является наиболее эффективным методом и дает подробные изображения с хорошей контрастностью.
Поляризационный фильтр также эффективен, однако он немного снижает разрешение и микроконтраст изображения. Изображение среза сердца без погружения или фильтра содержит множество отражений и не подходит для дальнейшего анализа. В планиметрическом анализе незатронутую сторону мозга следует сравнивать с пораженной инсультом стороной.
Ручные настройки камеры обеспечивают оптимальную экспозицию и баланс белого всех изображений, обеспечивая равномерный анализ. Примеры переэкспонированных и недоэкспонированных изображений срезов сердца показаны здесь. Кроме того, неправильные настройки баланса белого приводят к смещению изображения на синий или желтый и пурпурный или зеленый оттенок.
Научная макрофотография требует контролируемого освещения и соответствующей настройки изображения. Стандартизированная методология обеспечивает высококачественные, детализированные цифровые изображения. Этот метод применим ко всем экспериментальным фотографиям органов мелких животных.
