이 프로토콜은 심장 및 뇌 조직 슬라이싱 및 염색에 대한 적절한 방법론을 보여줍니다. 또한 조명 및 카메라 설정 및 이미지 획득을 위한 사진 기법 수립을 위한 지침도 제공합니다. 이러한 방법은 설치류 조직에서 이미지 평면 분석에서 측정을 수행하는 데 특히 유용하며 일반적인 과학 매크로 사진에 가치가 있습니다.
시작하려면 Krebs-Henseleit 용액으로 채워진 주사기에서 심장 캐뉼라를 분리하고 0.1 % 메틸렌 블루를 함유 한 따뜻한 Krebs-Henseleit 용액으로 채워진 주사기에 연결하십시오. 쥐 심장을 네 밀리리터의 메틸렌 블루 용액으로 분당 네 밀리리터의 속도로 관류시킨다. 주사기로부터 캐뉼라를 분리하고 캐뉼라로부터 심장을 제거한 후, 티슈 페이퍼 위에 심장을 부드럽게 롤링하여 과량의 메틸렌 블루를 제거한다.
과도한 메틸렌 블루를 제거한 후, 지혈 포셉을 열고 수술 봉합사 주변의 플라스틱 튜브를 제거하여 관상 동맥 주위의 합자를 느슨하게하십시오. 다음으로, 염색된 래트 심장을 슬라이싱을 위한 스테인레스 스틸 매트릭스에 놓는다. 심실을 두 밀리미터 두께의 조각으로 자르고 한 성인 쥐 심장에서 여섯 개에서 일곱 조각까지 목표로합니다.
절단 후 조각을 15 밀리리터 플라스틱 튜브로 옮깁니다. 이어서, PBS에 용해된 1%트리페닐테트라졸륨 클로라이드 5밀리리터를 심장 슬라이스가 있는 튜브에 첨가하고, 5분 후에 부드럽게 혼합하면서 섭씨 37도의 수조에서 10분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 심장 조각을 PBS로 적어도 두세 번 세척하고 이미지 캡처를 준비한다.
두개골에서 뇌 줄기를 포함한 뇌를 제거한 후 복부 측면이있는 뇌를 뇌 매트릭스에 올려 놓습니다. 동물의 무게에 따라 뇌 스테인레스 스틸 매트릭스의 올바른 크기를 선택하십시오. 블레이드를 사용하여 뇌의 전두엽 및 인과 부분을 제한하십시오.
그런 다음 블레이드를 첫 번째 블레이드와 마지막 블레이드 사이의 채널에 부분적으로 넣습니다. 모든 블레이드가 삽입되고 병렬로 배열되면 동시에 손바닥으로 모든 블레이드를 눌러 뇌를 두 밀리미터의 코로나 조각으로 자릅니다. 그런 다음 두 손가락으로 측면을 따라 블레이드를 단단히 잡고 매트릭스에서 얇게 썬 뇌와 함께 제거하십시오.
트레이에 뇌 조각을 하나씩 배열하여 각 슬라이스의 내부 표면이 항상 위를 향하게하십시오. 다음으로, 따뜻한 1% 트리페닐테트라졸륨 클로라이드 용액과 PBS를 뇌 조각에 붓고 어둠 속에서 섭씨 37도에서 8분 동안 배양한다. 인큐베이션 후 뇌 조각을 파란색 플라스틱 트레이로 옮겨 이미지를 캡처하십시오.
뇌 조각을 정면에서 꼬리 부분까지 순차적으로 배열하고 메스를 사용하여 시상면의 반구를 분리하십시오. 염색 직후 조직 조각을 촬영한다. 충전된 배터리, 메모리 카드 및 부착된 렌즈를 스탠드에 장착하여 원하는 카메라를 설치합니다.
사용 가능한 광원에 따라 적절한 화이트 밸런스 설정을 선택하거나 카메라 설명서의 지침에 따라 색온도 보정을 수행하십시오. 심장 조각을 PBS가있는 용기에 완전히 담그십시오. PBS 또는 다른 액체가없는 건조한 트레이에 뇌 조각을 배열하십시오.
슬라이스가 있는 컨테이너를 매크로 렌즈로 카메라 아래에 놓습니다. 모든 슬라이스가 시야에 완전히 맞고 동일한 평면에 있는지 확인하십시오. 카메라를 완전 수동 모드로 전환하고 ISO 100, 조리개를 F10으로 설정합니다.
최적의 이미지 노출을 위해 셔터 속도를 조정하고 카메라 초점 평면이 샘플이 배치된 표면과 평행한지 확인합니다. 샘플 번호를 캡처한 후 반사가 사라질 때까지 원형 편광 필터를 회전하고 셔터를 놓을 때 카메라가 흔들리지 않도록 원격 트리거를 사용하여 조직 조각을 이미지화한 다음 슬라이스를 회전하고 다른 쪽에서 이미지를 캡처합니다. 심근 경색 후 메틸렌 블루 및 트리페닐테트라졸륨 클로라이드로 염색된 심장 슬라이스의 이 사진은 경색 크기의 추가적인 평탄도 분석을 위한 충분한 디테일 및 색상 정보를 포함하고 있다.
24 시간 동안 심장 조직이 얼어 붙으면 완전성에 영향을 미치고 미토콘드리아 기능이 감소합니다. 따라서, 심장의 트리페닐테트라졸륨 클로라이드 염색은 적색이 아니라 옅은 분홍색이며, 괴사성 조직과 생존 가능한 조직 사이의 경계가 흐려진다. 시편의 반사를 줄이기 위해 비교한 두 가지 방법 중에서 침지가 가장 효율적인 방법이며 대비가 좋은 상세한 이미지를 생성합니다.
편광 필터도 효과적이지만 이미지의 해상도와 미세 대비를 약간 줄입니다. 침수 또는 필터가없는 심장 조각의 이미지에는 많은 반사가 포함되어 있으며 추가 분석에 적합하지 않습니다. 평면 분석에서 뇌의 영향을받지 않는면은 뇌졸중에 영향을받는 쪽과 비교되어야합니다.
수동 카메라 설정은 모든 이미지의 최적의 노출과 화이트 밸런스를 보장하여 균일한 분석이 가능합니다. 심장 조각의 과다 노출 및 노출 부족 이미지의 예가 여기에 나와 있습니다. 또한 잘못된 화이트 밸런스 설정으로 인해 이미지에서 파란색 또는 노란색 및 자홍색 또는 녹색으로 전환됩니다.
과학적인 매크로 사진을 찍으려면 제어된 조명과 적절한 이미징 설정이 필요합니다. 표준화 된 방법론은 고품질의 상세한 디지털 이미지를 보장합니다. 이 방법은 모든 실험적인 작은 동물 장기 사진에 적용 할 수 있습니다.
