このプロトコルは、心臓および脳組織のスライスおよび染色のための適切な方法論を示す。また、照明とカメラの設定、および画像取得のための写真技術を確立するためのガイドラインも提供します。これらの方法は、げっ歯類組織における画像平面解析における測定を行うのに特に有用であり、一般的な科学的マクロ写真にとって価値のあるものであり得る。
開始するには、クレブス-ヘンゼライト溶液で満たされたシリンジから心臓カニューレを取り外し、0.1%メチレンブルーを含む暖かいクレブス-ヘンゼライト溶液で満たされたシリンジに接続します。ラットの心臓に4ミリリットルのメチレンブルー溶液を毎分4ミリリットルの割合で灌流する。カニューレをシリンジから取り外し、カニューレから心臓を取り外した後、心臓をティッシュペーパー上で静かに転がすことによって余分なメチレンブルーを除去する。
余分なメチレンブルーを除去した後、止血鉗子を開き、外科用縫合糸の周りのプラスチックチューブを取り外すことによって冠状動脈の周りの結紮を緩める。次に、染色されたラット心臓をスライス用のステンレス鋼マトリックス中に置く。心室を厚さ2ミリのスライスに切り、1匹の成体ラット心臓から6〜7枚のスライスを目指します。
切断後、スライスを15ミリリットルのプラスチックチューブに移します。次いで、PBSに溶解した5ミリリットルの1%トリフェニルテトラゾリウムクロリドを心臓スライスを有するチューブに加え、5分後に穏やかに混合しながら摂氏37度の水浴中で10分間インキュベートする。インキュベーション後、心臓スライスをPBSで少なくとも2〜3回洗浄し、画像キャプチャの準備をする。
頭蓋骨から脳幹を含む脳を取り除いた後、腹側を上にして脳マトリックスに置きます。動物の体重に応じて、脳のステンレス鋼マトリックスの正しいサイズを選択してください。ブレードを使用して、脳の前頭部と尾部を制限します。
次に、最初のブレードと最後のブレードの間のチャネルにブレードを部分的に入れます。すべての刃を挿入して平行に配置したら、すべての刃を同時に手のひらで押し下げて、脳を2ミリメートルの冠状スライスに切断します。次に、2本の指で側面に沿ってしっかりと刃をつかみ、スライスした脳と一緒にマトリックスから取り除きます。
脳のスライスをトレイに1つずつ配置し、各スライスの内面が常に上を向いていることを確認します。次に、温かい1%トリフェニルテトラゾリウムクロリド溶液とPBSを脳スライスに注ぎ、暗所で摂氏37度で8分間インキュベートする。インキュベーション後、脳のスライスを青いプラスチックトレイに移して画像をキャプチャします。
脳のスライスを前頭部から尾部まで順に並べ、メスを使って矢状面の半球を分離します。染色直後の組織スライスを写真撮影する。充電済みのバッテリー、メモリーカード、付属のレンズをスタンドに取り付けて、お好みのカメラをセットアップします。
使用可能な光源に応じて、カメラのマニュアルの指示に従って、適切なホワイトバランス設定を選択するか、色温度のキャリブレーションを実行します。心臓のスライスをPBSの入った容器に完全に浸します。脳のスライスをPBSまたは他の液体を含まない乾燥トレイに並べる。
スライスの入ったコンテナをマクロレンズ付きのカメラの下に置きます。すべてのスライスが視野に完全に収まり、同じ平面上にあることを確認します。カメラをフルマニュアルモードに切り替え、ISO 100、絞りをF10に設定します。
最適な画像露出が得られるようにシャッタースピードを調整し、カメラの焦点面がサンプルが置かれている面に平行であることを確認します。サンプル番号を撮影後、反射が消えるまで円偏光フィルターを回転させ、リモートトリガーで組織スライスを撮像し、シャッターを離したときの手振れを防ぎ、スライスを回転させて反対側から撮影します。心筋梗塞後のメチレンブルーおよびトリフェニルテトラゾリウムクロリド染色心臓スライスのこの写真には、梗塞サイズのさらなる平面分析のための十分な詳細および色情報が含まれている。
心臓組織の24時間の凍結は完全性に影響を及ぼし、ミトコンドリア機能を低下させる。したがって、心臓のトリフェニルテトラゾリウムクロリド染色は赤色ではなく淡いピンク色であり、壊死組織と生存組織との間の境界がぼやけている。試料の反射を低減するために比較された2つの方法のうち、浸漬は最も効率的な方法であり、良好なコントラストを有する詳細な画像を生成する。
偏光フィルターも効果的ですが、画像の解像度とマイクロコントラストをわずかに低下させます。浸漬またはフィルターのないハートスライスの画像には多くの反射が含まれており、それ以上の分析には適していません。平面分析では、脳の罹患していない側を脳卒中の影響を受けた側と比較する必要があります。
手動カメラ設定により、すべての画像の最適な露出とホワイトバランスが確保され、均一な分析が可能になります。心臓スライスの露出過多および露出不足の画像の例をここに示します。さらに、ホワイトバランスの設定が正しくないと、画像が青または黄色、マゼンタまたは緑のキャストにシフトします。
科学的なマクロ写真には、制御された照明と適切なイメージング設定が必要です。標準化された方法論により、高品質で詳細なデジタル画像が保証されます。この方法は、全ての実験小動物臓器撮影に適用可能である。
