啮齿动物心脏和脑组织准备缺血后数码微距摄影

该协议显示了心脏和脑组织切片和染色的适当方法。它还为建立照明和相机设置以及用于图像采集的摄影技术提供了指南。这些方法对于在啮齿动物组织中进行图像平面分析的测量特别有用，并且对于一般的科学宏观摄影具有价值。

首先，将心脏套管从装有克雷布斯-亨塞莱特溶液的注射器上取下，并连接到装有含有0.1%亚甲蓝的温热克雷布斯-亨塞莱特溶液的注射器。以每分钟4毫升的速度用四毫升亚甲蓝溶液灌注大鼠心脏。将插管与注射器断开连接并从套管中取出心脏后，通过在薄纸上轻轻滚动心脏来去除多余的亚甲蓝。

去除多余的亚甲蓝后，通过打开止血钳并取下手术缝合线周围的塑料管来松开冠状动脉周围的结扎。接下来，将染色的鼠心放入不锈钢基质中进行切片。将心室切成两毫米厚的切片，目标是从一只成年大鼠心脏中切出六到七片。

切割后，将切片转移到15毫升的塑料管中。然后，将5毫升溶解在PBS中的1%三苯基氯化四氮唑加入试管中，并在5分钟后在37摄氏度的水浴中孵育10分钟，轻轻混合。孵育后，用PBS洗涤心脏切片至少两到三次，并准备拍摄图像。

从颅骨中取出大脑（包括脑干）后，将大脑的腹侧朝上放置在大脑基质中。根据动物的体重，选择正确大小的大脑不锈钢基质。使用刀片，限制大脑的额叶和尾部。

然后，将刀片部分放入第一个刀片和最后一个刀片之间的通道中。当所有刀片插入并平行排列时，同时用手掌将所有刀片向下压，将大脑切成两毫米的冕片。然后，用两根手指沿着两侧牢牢抓住刀片，并将它们与切成薄片的大脑一起从基质中取出。

将脑切片逐个排列在托盘中，确保每个切片的内表面始终朝上。接下来，将温热的1%三苯基氯化四氮唑溶液和PBS倒入脑切片中，并在黑暗中在37摄氏度下孵育8分钟。孵育后，将大脑切片转移到蓝色塑料托盘中以捕获图像。

按顺序排列从额叶到尾部的脑切片，并使用手术刀将矢状面中的半球分开。染色后立即拍摄组织切片。在支架上设置带电电池、存储卡和附加镜头的相机。

根据可用的光源，选择适当的白平衡设置或根据相机手册中的说明执行色温校准。将心脏切片完全浸入装有PBS的容器中。将脑切片放在没有PBS或其他液体的干燥托盘中。

将装有切片的容器放在带有微距镜头的相机下方。确保所有切片完全适合视野，并且位于同一平面上。将相机切换到完全手动模式，将ISO 100设置为F10，光圈设置为F10。

调整快门速度以获得最佳图像曝光，并确保相机焦平面平行于放置样品的表面。捕获样品编号后，旋转圆偏振滤光片直到反射消失，并使用远程触发器对组织切片进行成像，以防止在释放快门时相机抖动，然后旋转切片并从另一侧捕获图像。这张心肌梗死后亚甲蓝和三苯基氯化四氮唑染色心脏切片的照片包含足够的细节和颜色信息，可用于进一步对梗死大小进行平面分析。

心脏组织冷冻24小时会影响完整性并降低线粒体功能。因此，心脏的三苯基氯化四氮氯化物染色不是红色而是淡粉红色，并且坏死组织和活组织之间的边界模糊。在比较的两种减少试样反射的方法中，浸入是最有效的方法，可以产生具有良好对比度的详细图像。

偏振滤光片也很有效，但是，它会略微降低图像的分辨率和微对比度。没有浸入或过滤的心脏切片的图像包含许多反射，不适合进一步分析。在平面分析中，应将大脑未受影响的一侧与中风受影响的一侧进行比较。

手动相机设置可确保所有图像的最佳曝光和白平衡，从而实现统一的分析。此处显示了心脏切片的过度曝光和曝光不足图像的示例。此外，不正确的白平衡设置会导致图像中出现蓝色或黄色以及洋红色或绿色色偏。

科学的微距摄影需要受控的照明和适当的成像设置。标准化的方法确保了高质量、详细的数字图像。该方法适用于所有实验性小动物器官摄影。