Этот протокол полезен для долгосрочного сохранения кошачьих яйцеклеток с помощью метода криоконсервации, известного как витрификация, которая имеет решающее значение для сохранения плодородия и биоразнообразия у видов животных. Основными преимуществами витрификации являются ее скорость, поскольку она может быть завершена менее чем за 17 минут, и ее осуществимость в полевых условиях при наличии жидкого азота. Домашняя кошка является жизнеспособной моделью для диких кошачьих, находящихся под угрозой исчезновения.
Разработка и оптимизация криоконсервации протоколов позволит создание gamete биобанков для кошачьих программ сохранения. Начните с подготовки пластины витрификации Repro с тремя коническими скважинами в одном ряду. Добавьте 20 микролитров эквилибрового раствора к первой скважине и 300 микролитров витрификационных растворов к второй и третьей скважинам.
Чтобы уравночные комплексы кумулятивных ооцитов, или COCs, использовать малой скважины пипетки для передачи одного или нескольких комплексов на дно первой скважины. Медленно добавьте 20 микролитров эквилибрового раствора к границе капли и подождите три минуты, затем добавьте еще 240 микролитров эквилибров раствора эквилибрации и подождите девять минут. Во время ожидания подготовь коробку с жидким азотом и обозначить поддержку витрификации с помощью эксперимента или кода идентификации кота.
Положите коробку и поддержку возле стерео микроскопа. После эквилибрации COCs, выполнить витрификации менее чем за 90 секунд. Чтобы витрифицировать COCs, заполните малой родила пипетки с витрификации раствор из второй скважины.
Возьмите КОК со дна первой колодец и перемести их на поверхность второй колодец. Вымойте пипетку раствором витрификации, затем переместите COCs в другую область колодец и смешайте окружающий раствор. Заполните пипетки раствором из другой области колодец.
Переместите COCs и смешайте окружающую их среду с пипеткой. Повторите этот процесс еще раз. Затем вымойте пипетку раствором витрификации из третьей хорошо и использовать его для перемещения COCs на дно третьей хорошо.
Опять же, смешать окружающий раствор. После заполнения пипетки раствором из другой области колодец, переместить COCs и смешать раствор. Повторите этот процесс.
Заполните наконечник пипетки раствором витрификации из другой области хорошо и использовать его для загрузки COCs на полосе витрификации поддержки близко к кончику, а затем аспирировать избыток среды. Немедленно окуните поддержку витрификации в жидкий азот и используйте зажимы, чтобы закрыть его, убедившись, что он остается погруженным. Храните загруженные витрификационые опоры в кубке и храните их в резервуаре для хранения жидкого азота до потепления.
Поместите этап нагрева близко к стерео микроскопу и включите его до 38 градусов по Цельсию. Разогреть крышку чашки Петри в верхней части сцены, а затем передать витрификации поддерживает из резервуара для хранения в коробку с жидким азотом. Подготовьте один ряд пластины Repro для каждой поддержки витрификации, которая будет нагреваться.
Добавьте 300 микролитров раствора разбавления к первой скважине и 300 микролитров стирального раствора во вторую и третью скважины. Вынешь раствор оттаивания из инкубатора и урони 100 микролитров на крышку чашки Петри. Используйте зажимы, чтобы открыть поддержку витрификации внутри жидкого азота.
Поместите крышку чашки Петри под стерео микроскопом, затем быстро подберите поддержку витрификации и погрузите ее полосу в каплю, перемещая ее до тех пор, пока все COCs не отсоединятся. Удалите поддержку с капли, как только она пуста, но оставьте COCs в растворе оттаивания на одну минуту. Заполните пипетку раствором разбавления и используйте ее для перемещения COCs от оттаивания раствора падение на дно первой хорошо с раствором разбавления.
Оставьте КОК там на три минуты. Вымойте пипетку раствором для мытья со второй хорошо, затем возьмите COCs и переместить их на дно второй хорошо. Подожди пять минут.
Вымойте пипетку раствором из третьей хорошо и использовать его для перемещения COCs от второй колодец на поверхность третьей хорошо. Подождите, пока COCs коснуться нижней части третьей хорошо. Затем повторите процесс с другой областью хорошо.
После завершения, мыть пипетку с культурой среды и переместить яйцеклетки в культуру блюдо. Подавляющее большинство gametes выжить после витрификации яйцеклеток и потепления в соответствии с этим протоколом. Здесь показана репрезентативная картина жизнеспособного стекловидного подогретого кошачьего кумуляторного ооцитного комплекса, окрашенного флуоресцеином диацетатом и йодидом пропидия.
Эта таблица показывает процент выживаемости после витрификации, которая изображает пост-потепление данных ооцитов, предназначенных для созревания in vitro. Из 435 яйцеклеток, 395 выжили, забив в целом 90,8% после потепления жизнеспособности. Тем не менее, некоторые морфологические изменения могут быть замечены после потепления.
Наиболее частыми морфологическими аномалиями являются изменения формы и гранулирования ооплазмы, частичная, а иногда и полная потеря кучевых клеток и переломы зоны пеллукиды. При попытке этой процедуры, не забудьте подготовить средства массовой информации заранее, так что они являются правильной температуры перед использованием и следовать протоколу температуры и сроки, чтобы избежать токсичности клеток. Протокол также может применяться к яйцеклеткам других видов.
В случае успеха, это может также способствовать микробной плазмы банковской для сохранения биоразнообразия в находящихся под угрозой исчезновения кошачьих.
