Поддержание потенциальной жизнеспособности ооцитов после длительного хранения представляет собой инструмент больших возможностей, поскольку это улучшит разведение домашних животных с помощью программ генетического отбора, будет способствовать сохранению биоразнообразия путем сохранения видов дикой природы и увеличит исследования в области биотехнологии. Витрификация ювенильных ооцитов была намного короче в интервале генерации в селекционных программах. Витринование сверхчистым охлаждением и согреванием считается стандартным подходом в сохранении ооцитов крупного рогатого скота.
Однако у овец эта процедура все еще считается относительно новой и стандартный метод отсутствует. В этом видео мы описываем протокол витрификации овечьих ооцитов, собранных как у молодых, так и у взрослых доноров, и in vitro созрели до криоконсервации. Протокол включает в себя все процедуры от созревания in vitro, витрификации, согревания и послеогревающей культуры.
После восстановления комплекса Cumulus oocytes, где созревает in vitro в течение 24 часов в статическом состоянии, которое включает для ювенильных ооцитов, добавление ста микромоляров трегалозы в среду созревания. После созревания in vitro ооциты механически оголяли кучевые клетки путем мягкого пипетирования и исследовали под стереомикроскопом с 60-кратным увеличением. Выбор ооцитов для подачи на процедуры витрификации представляет собой первый важный шаг к гарантии успешного применения этой процедуры.
Должны быть выбраны только те, которые имеют однородную цитоплазму, с однородным распределением липидных капель, целостностью всей Эммы широкой и непрерывной поворотной в пространстве, компактной пеллюцидной зоной наружного диаметра около 19 мкм и показывающей экструзию первого полярного тела, и, таким образом, на стадии М2. Витрификацию проводили методом минимально необходимого объема, с помощью криотопового устройства. После отбора группу из пяти ювенильных ооцитов кондиционировали при 38,5 градусах Цельсия в базовой среде в течение двух минут.
Затем ооциты обезвоживали трехминутным воздействием калибровочного раствора. Нагрузка на яйцеклетку в используемом витрификации устройстве является важным и критическим этапом. Криотоп использует полипропиленовую полосу, прикрепленную к держателю.
При этом способе ооциты в растворе витрификации, менее 0 точечного миллилитра, быстро нагружаются стеклянным капилляром поверх пленочной полосы. Затем раствор необходимо удалить, оставив после себя тонкий слой, достаточно покрывая клетки для криоконсервирования. Перед загрузкой в криотоп устройство и непосредственно погружают в жидкий азот в течение 30 секунд.
Для теплой внутренней биологической температуры содержимое каждого устройства витрификации переносили из жидкого азота в 200 микролитровых капель убывляющего раствора трегалозы. Ооциты переносили набором, перетаскивая ооциты тонкой, стеклянной пипеткой, чтобы способствовать удалению внутричерелезных криопротекторов. Наконец, ооциты были предварительно выведены в базовой среде в инкубаторе с содержанием 5% углекислого газа.
Сразу после потепления и для каждой временной точки послегреющей культуры ооциты морфологически оценивали с помощью перевернутого микроскопа со 100-кратным увеличением. Криоустойчивость ооцитов от ювенильных доноров ниже по сравнению с измененными с более низкой целостностью мембраны после нагревания. Применение трегалозы в среде созревания индуцирует в ювенильных ооцитах более высокую целостность мембраны, повышая выживаемость после витрификации.
Однако расщепление, оплодотворение и скорость развития ювенильных ооцитов не были увеличены добавками трегалозы. Использование сред с концентрацией кальция, равной 2,2 миллиграммам децилитра для витрификации ювенильных ооцитов, должно превышать показатели оплодотворения по сравнению с ооцитами, витрифицированными концентрацией кальция, но не было обнаружено различий, позволяющих продактировать. Сравнивая послегретую культуру на разной продолжительности, мы показали, что после четырех часов культуры ооциты, собранные у старших двоек, способны восстанавливать энергетические связи и микротрубчатую установку, а также восстанавливать компетенцию развития с более высоким расщеплением и отходами бластоцитов.
Митохондриальная активность была выше в отрифицированных теплых ювенильных ооцитах после четырех часов культуры после потепления по сравнению с другими временными точками. Митохондриальное распределение расставания также изменилось в течение шести часов после потепления культуры. Кроме того, внутриклеточные уровни активных форм кислорода были значительно ниже в ювенильных ооцитах через два часа после нагревания культуры по сравнению с 0, 4 и 6 часами.
Однако, в отличие от того, что обнаружено в других ооцитах, скорость спонтанной партеногентической активации увеличивалась во время послегреющей культуры в ювенильных ооцитах. Одним из главных преимуществ предлагаемого метода является то, что он включает в себя все этапы от сбора ооцитов до созревания in vitro, витрификации и согревания. Кроме того, он включает в себя период после нагревания культуры, чтобы позволить яйцеклетки восстановиться после повреждений, понесенных во время процедуры витрификации.
Выбор оптимального времени для оплодотворения является сложной задачей, и это может повлиять на результат программы витрификации. Следует также учитывать, что, в отличие от медленного замораживания, витрификация является ручной техникой и, следовательно, зависит от оператора. По этой причине основной проблемой является потребность в квалифицированных техниках и исследователях, которые учитывают эффект оператора при оценке результатов программы витрификации.
Дальнейшие исследования, полученные в нашей лаборатории, позволят стандартизировать процедуру и отбор витрификации ооцитов, а также лучше адаптировать состав среды к потребностям ювенильного ооцита. Пренебрежением к использованию культуры и характера и антиоксиданта мы предлагаем многообещающие возможности.
