未成熟费林卵母细胞的最小体积玻璃化

该协议有助于通过称为玻璃化的低温保存技术长期保护猫卵母细胞，这对动物物种的生育和生物多样性保护至关重要。玻璃化的主要优点是速度，因为它可以在17分钟内完成，如果有液氮的话，在野外条件下可行。家猫是野生濒危猫科动物的可行模式。

冷冻保存协议的开发和优化将允许为猫科动物保护计划建立游戏生物库。首先准备一个重现玻璃化板，一排有三个锥形井。在第一口井和三井中加入20微升平衡溶液，在第二和第三口井中加入300微升玻璃化溶液。

要平衡积液卵母细胞复合物或 COC，请使用小孔移液器将一个或多个复合物转移到第一口井的底部。缓慢地将 20 微升的均衡溶液添加到跌落的边界中，等待三分钟，然后再添加 240 微升的均衡溶液，等待 9 分钟。在等待时，准备一个带液氮的盒子，并用实验或猫识别码标记玻璃化支持。

将盒子和支撑放在立体显微镜附近。平衡 COC 后，在 90 秒内执行玻璃化。要对 COC 进行玻璃化，请用第二孔的玻璃化溶液填充小孔移液器。

将 COC 从第一个井的底部移动，并移动到第二个井的表面。使用玻璃化溶液清洗移液器，然后将 COC 移动到井的另一个区域，然后混合周围的溶液。用从井的另一个区域填充移液器。

移动 COC，将周围的介质与移液器混合。重复此过程一次。接下来，用第三井的玻璃化溶液清洗移液器，并用它来将COC移动到第三井的底部。

再次，混合周围的解决方案。从井的另一个区域用溶液填充移液器后，移动 COC 并混合溶液。重复此过程。

用井的另一个区域的玻璃化溶液填充移液器尖端，并用它来将COC加载到靠近尖端的玻璃化支撑条上，然后吸气多余的介质。立即将玻璃化支持液中浸在液氮中，并使用夹子关闭，确保保持浸入。将装载的玻璃化支架存放在杯中，并存放在储存液氮罐中，直到加热。

将加热台靠近立体显微镜，将其打开至 38 摄氏度。加热舞台顶部的培养皿盖，然后将玻璃化支架从储罐转移到含有液氮的盒子里。准备一排重现板，用于加热每个玻璃化支撑。

在第一口井中加入300微升稀释溶液，在第二和第三井中加入300微升的洗涤溶液。将解冻溶液从培养箱中取出，在培养皿的盖子上滴下100微升。使用夹子打开液氮内的玻璃化支撑。

将 Petri 盘盖放在立体显微镜下，然后快速拿起玻璃化支撑，将其条带浸入落点中，将其移动，直到所有 COC 分离。一旦跌落为空，立即从跌落中卸下支撑，但将 COC 留在解冻溶液中一分钟。用稀释溶液填充移液器，并用它来将COC从解冻溶液滴到第一井的底部，使用稀释溶液。

把 COC 留在那里三分钟。用洗涤液从第二个井清洗移液器，然后采取COC，并移动到第二个井的底部。等待五分钟。

用第三个井的溶液清洗移液器，并用它来将 COC 从第二个井移动到第三井的表面。等待 COC 触摸第三个井的底部。然后用另一个井区重复此过程。

完成后，用培养介质清洗移液器，将卵母细胞移动到培养皿中。根据该协议，绝大多数的游戏体在卵母细胞玻璃化和变暖后存活。此处显示了一个可行的维他化温暖猫积卵母细胞复合物与荧光素二甲酸酯和碘化二甲酸酯的代表性图片。

下表显示了玻璃化后生存的百分比，其中描述了用于体外成熟的卵母细胞的加热后数据。在435个卵母细胞中，395个存活下来，在变暖后总体获得90.8%的生存能力。然而，一些形态的变化可以注意到后，变暖。

最常见的形态异常是表粒形状和造粒的变化，部分或有时完全丧失积糖细胞，以及佐纳佩普图西达骨折。尝试此过程时，请提前准备介质，以便它们在使用前达到正确的温度，并遵循协议温度和时间以避免细胞毒性。该协议也可以适用于其他物种的卵母细胞。

如果成功，这也可能有助于为濒危猫科动物的生物多样性保护提供细菌。