Этот протокол описывает некоторые методы количественной оценки образования липидных капель в кишечных органоидах человека. Он может быть использован в качестве высокой пропускной способности скрининговой платформы для тестирования на препараты, которые модулируют образование липидных капель. Метод, который мы описываем, основан на липидном капельном красителе и кишечных органоидах, полученных биопсией.
Таким образом, она обеспечивает стабильную, точную и физиологически-релевантную модель формирования липидных капель. Этот протокол может быть использован для проверки для конкретных пациентов новых кандидатов наркотиков, которые модулируют образование липидных капель, например, у пациентов с дефицитом DGAT1. Этот анализ образования капель липидов также может быть применен к другим типам органоидных культур для изучения метаболизма липидов в других типах клеток.
Анализ в значительной степени зависит от плотности органоидной культуры. Старайтесь обеспечить последовательную плотность органоидов в образцах и экспериментах. Визуальная демонстрация этого анализа имеет решающее значение, потому что важно показать, как органоид должен быть культурным и как они должны быть обработаны для обеспечения надлежащего анализа формирования липидных капель.
После подготовки органоидов, тщательно аспирировать культурную среду, не нарушая капель мембранной матрицы подвала. Добавьте 500 микролитров холодной базальной среды к первой колодец органоидов. Используя P1000 пипетку, осторожно пипетки вверх и вниз, чтобы нарушить мембрану подвала матричных капель с органоидами.
Повторите эту процедуру с той же среде в следующем также, как требуется, но не собирают более двух скважин на 500 микролитров базальной среды. Соберите органоиды в низкообязательную микроцентрифугную трубку с низким содержанием 1,5 миллилитров и вращайте их в центрифуге с мини-столешницей в течение 15-20 секунд. Добавьте 400 микролитров трипсина в закрученные органоиды.
Инкубировать в водяной бане при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Далее используйте пипетки P200, чтобы аккуратно пипетки подвески вверх и вниз, чтобы нарушить оставшиеся агрегаты клеток. Инкубировать в водяной бане при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Когда останутся только одиночные клетки, добавьте один миллилитр базальной среды и вращайте клетки в центрифуге с мини-столешницей в течение 15-20 секунд. Аспирировать супернатант полностью. Используйте пипетки P200 для повторной приостановки одиночных ячеек в 200 микролитров свежих hSI-EM и добавления дополнительных 800 микролитров hSI-EM.
Затем подсчитайте количество ячеек в суспензии и рассчитайте объем ячеек, необходимых для окончательной плотности клеток. Вынюйте соответствующий объем подвески и отрегулируйте плотность до 750 клеток на микролитер. Добавьте мембранную матрицу к клеточной подвеске в соотношении два к одному.
Аккуратно пипетка подвески смешать быть осторожным, чтобы избежать создания пузырьков. В предварительно разогретой пластине культуры, семена из трех 10-микролитровых капель на скважину, если пластина имеет 24 скважин или один пятиминер капли на скважину, если пластина имеет 96 скважин. Поместите пластину в инкубатор при 37 градусах по Цельсию с пятипроцентным углекислым газом в течение 10-15 минут, чтобы затвердеть капли.
Между тем, предварительно разогреть соответствующий объем hSI-EM-Y в водяной бане при 37 градусах по Цельсию. После этого аккуратно добавьте предварительно разогретый hSI-EM-Y к каждому колодец пластины. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с пяти процентов углекислого газа.
Через два-три дня замените носитель на hSI-EM и не забудьте обновить ее два-три раза в неделю. Во-первых, весят 0,2 грамма жидкой олеиновой кислоты при комнатной температуре. Добавьте 1,5 миллилитров стерильного PBS культурного класса и нагревайте смесь до 70 градусов по Цельсию в течение одного часа, убедившись, что вихрь периодически.
Затем взвесьте 5,89 грамма без жирных кислот BSA и растворите его в 33,9 миллилитров PBS. Разогреть смесь на водяной бане при 37 градусах по Цельсию до полного растворения BSA. Vortex олеиновой кислоты смесь снова создать эмульсию мелких капель и сразу же добавить его в раствор BSA с помощью стеклянной пипетки.
Держите смесь при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут, пока не останется ясный желтоватый раствор. Прохождение органоидов, как описано ранее, и семян из органоидных полученных одиночных клеток в черный ясно-дно 96-хорошо пластины. На шестой день культивирования на hSI-EM, заменить культурную среду с hSI-EM, содержащий один миллимолар олеиновой кислоты и BSA конъюгации.
Инкубировать клетки в течение 16 до 17 часов при 37 градусах Цельсия при наличии или отсутствии ингибитора 0,1 микромолара DGAT1. После этого, аспирировать среды, не нарушая мембраны мембраны матричных капель. Зафиксировать органоиды, добавив 100 микролитров четырехпроцентного нейтрального буферного формальдегида в скважины в течение 30 минут при комнатной температуре.
Снимите формальдегид осторожно и тщательно промыть клетки с 150 микролитров PBS на колодец. Пятно клеток для липидных капель с 025 миллиграммов на миллилитр LD540 и DAPI в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Затем тщательно промыть колодцы с PBS.
Для обзорных изображений целых органоидов используйте 40X субъективный подходит для конфокальных флуоресцентных изображений. Установите микроскоп для изображения DAPI и красителя LD540 с использованием параметров возбуждения и выбросов, показанных здесь. Установите размер пинхол до одного воздушного блока для достаточного разрешения z-оси.
Для изображения половины сферического органоида установите z-стек примерно до 85 микрометров. Используя соответствующую систему обработки изображений, преобразуйте z-стек каждого органоида в максимальную проекцию, нажав на изображение, стеки, проект. Установите порог максимальной проекции до уровня, при котором в образце управления транспортным средством BSA нет сигнала LD540, нажав на изображение, отрегулируйте, порог.
Используйте эти настройки для порога каждого изображения. Затем измерьте общую площадь флуоресценции для каждой максимальной проекции с помощью функции Анализируйте, анализируйте частицы. Для правильного анализа образования липидных капель органоиды не должны быть посеяны слишком плотно до стимуляции олеиновой кислотой и последующим окрашиванием.
Это особенно важно для конфокального и пластины читателя считывания, поскольку перекрывающиеся органоиды могут вмешиваться в флуоресценцию. После стимуляции с одним миллимоляном олеиновой кислоты на ночь образование липидных капель можно визуализировать с помощью перевернутого ярко-полевого микроскопа. Накопление липидных капель рассеивает передаваемый свет, и поэтому органоиды кажутся темнее, в то время как не стимулированные органоиды имеют полупрозрачный вид.
После того, как олеиновой кислоты стимулировали органоиды фиксируются и окрашены, липидные капли формирования могут быть визуализированы с помощью конфокального микроскопа. Поскольку органоиды являются 3D структурами, обычный эпифлуоресцентный микроскоп не подходит из-за внефокусного фонового сигнала, поэтому конфокальный z-стек используется для характеристики LDF в органоидах. Количественная оценка образцов конфокальные микроскопии также может быть выполнена с помощью флуоресцентного считывателя пластин, нормализуемого к флуоресцентного сигнала Hoechst.
Анализ считывателя пластин указывает на значительное снижение сигнала LD540 в органоидных клетках, обработанных ингибитором DGAT1 по сравнению с необработанными органоидами. Количественная оценка образования LD в отдельных клетках может быть достигнута с помощью цитометра потока. Стратегия gating показанная здесь для dissociated людских кишечных organoids.
Репрезентативные гистограммы как для SSC-A, так и для сигнала LD540 окончательной популяции живых клеток показывают, что образование липидных капель приведет к увеличению SSC-A из-за образования внутриклеточных липидных капель. Кроме того, LD540 пятна для липидов, которые хранятся в липидных капель, и сигнал будет также увеличиваться при индукции образования липидных капель. Таким образом, образование липидных капель измеряется как сдвиг в среднем флуоресцентной интенсивности как SSC-A, так и LD540.
Наиболее важными шагами этого протокола являются культура кишечных органоидов человека и надлежащее гофрирование олеиновой кислоты к BSA. Чтобы приспособить больше условий, этот анализ может быть проанализирован с помощью флуоресцентного считывателя пластин. Чтобы исправить число органоидов на колодец, сигнал LD540 был нормализован к сигналу DAPI.
С помощью этого метода, исследователи могут изучать образование липидных капель в органоидных системах, и улучшить различные методы анализа, такие как электронная микроскопия для проверки своих выводов.
