يصف هذا البروتوكول بعض الطرق لتحديد تكوين قطرات الدهون في الأعضاء المعوية البشرية. ويمكن استخدامه كمنصة فحص عالية الإنتاجية لاختبار الأدوية التي تعدل تكوين قطرات الدهون. ويستند الأسلوب الذي يصفنا على صبغة قطرة الدهون الخاصة و organoids المشتقة من خزعة الأمعاء.
وبالتالي فإنه يوفر نموذج مستقر ودقيق، وفسيولوجيا ذات الصلة لتشكيل قطرات الدهون. يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص المرشحين المخدرات رواية خاصة المريض أن تعديل تكوين قطرات الدهون، على سبيل المثال، في المرضى الذين يعانون من نقص DGAT1. ويمكن أيضا أن يطبق هذا المقايسة تشكيل قطرات الدهون إلى أنواع أخرى من الثقافات العضوية لدراسة التمثيل الغذائي للدهون في أنواع الخلايا الأخرى.
يعتمد الفحص إلى حدّ بعيد على الكثافة من الثقافة عضويّة. حاول ضمان وجود كثافة أعضاءية متسقة عبر العينات والتجارب. إن العرض المرئي لهذه التحاليل أمر بالغ الأهمية لأنه من المهم إظهار كيف ينبغي أن يكون مستزرعاً في الجهاز العضوي وكيف ينبغي التعامل معه لضمان التحليل السليم لتشكيل قطرات الدهون.
بعد إعداد organoids، pirate بعناية المتوسطة الثقافة دون إزعاج قطرات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي. إضافة 500 ميكرولترات من الوسط القاعدي البارد إلى أول بئر من organoids. باستخدام ماصة P1000، ماص بلطف صعودا وهبوطا لتعطيل قطرات مصفوفة غشاء الطابق السفلي مع organoids.
كرر هذه الإجراءات بنفس الوسيلة في البئر التالية كما هو مطلوب، ولكن لا تحصد أكثر من بئرين لكل 500 ميكرولتر من الوسط القاعدي. جمع organoids في انخفاض ملزمة 1.5 ملليلتر microcentrifuge أنبوب، وتدور عليها في جهاز طرد مركزي مصغرة الطاولة لمدة 15 إلى 20 ثانية. إضافة 400 ميكرولترات من التربسين إلى organoids نسج أسفل.
احتضان في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، استخدم ماصة P200 إلى ماصة بلطف تعليق صعودا وهبوطا لتعطيل المجاميع المتبقية من الخلايا. احتضان في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
عندما تبقى خلايا واحدة فقط، إضافة ملليلتر واحد من المتوسطة القاعدية، وتدور أسفل الخلايا في جهاز طرد مركزي مصغرة المنضدة لمدة 15 إلى 20 ثانية. استلهموا المُتفوّك تماماً استخدام ماصة P200 لإعادة تعليق الخلايا الفردية في 200 ميكرولترات من هسي-EM الطازجة، وإضافة 800 ميكرولترات إضافية من hSI-EM.
ثم عد عدد الخلايا في التعليق وحساب حجم الخلايا اللازمة لكثافة الخلية النهائية. إخراج حجم مناسب من التعليق وضبط كثافة إلى 750 الخلايا في ميكرولتر. إضافة مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى تعليق الخلية في نسبة اثنين إلى واحد.
الماص بلطف تعليق لخلط يجري حذرا لتجنب خلق فقاعات. في لوحة ثقافة مسبقة الدفء، بذور من أصل ثلاث قطرات 10 ميكرولتر في البئر إذا كان لوحة لديها 24 آبار أو قطرة واحدة خمسة ميكرولتر لكل بئر إذا كان لوحة لديها 96 آبار. ضع الطبق في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع خمسة في المئة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 إلى 15 دقيقة لترسيخ القطرات.
وفي الوقت نفسه، قبل الدافئة حجم مناسب من hSI-EM + Y في حمام مائي في 37 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بإضافة hSI-EM+Y التي تم تسخينها مسبقًا إلى كل بئر من الألواح. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع خمسة في المئة من ثاني أكسيد الكربون.
بعد يومين إلى ثلاثة أيام، استبدال المتوسطة مع hSI-EM وتأكد من تحديثه مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع. أولاً، تزن 0.2 غرام من حمض الأوليك السائل في درجة حرارة الغرفة. إضافة 1.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقم من الدرجة الثقافة وتسخين الخليط إلى 70 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع التأكد من دوامة بشكل متقطع.
بعد ذلك، وزن 5.89 غراما من BSA الدهنية خالية من الأحماض وحلها في 33.9 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. سخني الخليط في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يذوب BSA بالكامل. دوامة خليط حمض الأوليك مرة أخرى لخلق مستحلب من قطرات غرامة وإضافته على الفور إلى حل BSA باستخدام ماصة زجاجية.
حافظ على الخليط عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يبقى محلول مصفر واضح. مرور organoids كما وصف سابقا والبذور من الخلايا الفردية المشتقة من organoid في لوحة سوداء واضحة القاع 96 جيدا. في اليوم السادس من زراعة على hSI-EM، استبدال المتوسطة الثقافة مع hSI-EM تحتوي على ملليمتر واحد من حمض الأوليك وBSA conjugate.
احتضان الخلايا لمدة 16 إلى 17 ساعة في 37 درجة مئوية في وجود أو عدم وجود مثبطات DGAT1 ميكرومولار. بعد هذا، التعرق المتوسطة دون إزعاج قطرات مصفوفة غشاء الطابق السفلي. إصلاح الأعضاء عن طريق إضافة 100 ميكرولترات من أربعة في المئة غير محايدة الفورمالديهايد إلى الآبار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
إزالة الفورمالديهايد بلطف وبعناية غسل الخلايا مع 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في بئر. وصمة عار الخلايا لقطرات الدهون مع 025 ملليغرام لكل ملليلتر LD540 وDAPI في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ثم غسل الآبار بعناية مع برنامج تلفزيوني.
للحصول على صور عامة من organoids كله استخدام 40X الذاتية مناسبة لتصوير الفلورسنت confocal. تعيين المجهر على صورة لDAPI وصبغة LD540 باستخدام إعدادات الإثارة والانبعاثات هو مبين هنا. تعيين حجم الثقب إلى وحدة واحدة مُهّرة لدقة كافية المحور ع.
لصورة نصف من الأعضاء الكروية تعيين z المكدس إلى ما يقرب من 85 ميكرومتر. باستخدام نظام مناسب لمعالجة الصور ، وتحويل z - المكدس من كل organoid إلى أقصى الإسقاط بالنقر على الصورة ، والمكدسات ، Z المشروع. تعيين عتبة الإسقاط الأقصى إلى مستوى حيث لا يوجد إشارة LD540 مرئية في عينة التحكم في السيارة BSA عن طريق النقر على الصورة، ضبط، عتبة.
استخدم هذه الإعدادات لعتبة كل صورة. ثم قياس المساحة الإجمالية للفلوريسنس لكل إسقاط الحد الأقصى باستخدام وظيفة تحليل، تحليل الجسيمات. للتحليل السليم لتشكيل قطرات الدهون، لا ينبغي أن تكون organoids بذرة كثيفة جدا قبل التحفيز مع حمض الأوليك وتلطيخ اللاحقة.
هذا هو أهمية خاصة للقراءة confocal ولوحة القارئ منذ العضية المتداخلة قد تتداخل مع fluorescence. بعد التحفيز مع ملليمتر واحد من حمض الأوليك بين عشية وضحاها، يمكن تصور تكوين قطرات الدهون مع مجهر مقلوب مشرق المجال. تراكم قطرات الدهون ينثر الضوء المنقولة، وبالتالي تظهر organoids أغمق، في حين أن organoids غير محفزة لها مظهر شفاف.
مرة واحدة يتم إصلاحها والأجهزة الأحماض الأوليك حفز وملطخة، ويمكن تصور تكوين قطرات الدهون باستخدام المجهر confocal. كما organoids هي هياكل 3D ، والمجهر epifluorescent العادية ليست مناسبة بسبب إشارة خلفية خارج التركيز ، لذلك يتم استخدام confocal z المكدس لتوصيف LDF في organoids. كما يمكن إجراء القياس الكمي لعينات المجهر الميكروفي باستخدام قارئ لوحة فلورية يتم تطبيعه إلى إشارة هويشست الفلورسنت.
يشير مقايسة قارئ اللوحة إلى انخفاض كبير في إشارة LD540 في الخلايا العضوية المعالجة بمثبط DGAT1 مقارنة بالأعضاء غير المعالجة. يمكن تحقيق القياس الكمي لتشكيل LD في الخلايا الفردية باستخدام مقياس تدفق الخلايا. استراتيجية البوابات الموضحة هنا هي لعضوية الأمعاء البشرية المنفصلة.
تظهر مخططات التكرار التمثيلي لكل من SSC-A وإشارة LD540 للسكان الخلية الحية النهائية أن تكوين قطرات الدهون سيؤدي إلى زيادة في SSC-A بسبب تكوين قطرات الدهون داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، LD540 البقع للدهون التي يتم تخزينها في قطرات الدهون، وسوف تزيد أيضا إشارة على تحريض تشكيل قطرات الدهون. على هذا النحو، يتم قياس تكوين قطرات الدهون كتحول في متوسط كثافة الفلورسنت لكل من SSC-A و LD540.
الخطوات الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هي ثقافة الأعضاء المعوية البشرية والمكور السليم من حمض الأوليك إلى BSA. لاستيعاب المزيد من الشروط، يمكن تحليل هذا الفحص باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت. لتصحيح عدد الأعضاء في البئر، تم تطبيع إشارة LD540 إلى إشارة DAPI.
مع هذه التقنية، يمكن للباحثين دراسة تكوين قطرات الدهون في الأنظمة العضوية، وتحسين تقنيات التحليل المختلفة مثل المجهر الإلكتروني للتحقق من صحة النتائج التي توصلوا إليها.
