פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות לכמת היווצרות טיפת השומנים באורגנואידים מעיים אנושיים. זה יכול לשמש כפלטפורמת סינון תפוקה גבוהה כדי לבדוק תרופות לווסת היווצרות טיפת השומנים. השיטה שאנו מתארים מבוססת על צבע ספציפי לירידה בדם ואיברנואידים מעיים שמקורם בביופסיה.
בכך הוא מספק מודל יציב, מדויק ורלוונטי מבחינה פיזיולוגית להיווצרות טיפות שומנים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לסנן עבור מועמדים תרופה חדשה ספציפית למטופל לווסת את היווצרות טיפות השומנים, למשל, בחולים DGAT1-לקוי. זה טיפת השומנים היווצרות assay יכול להיות מיושם גם על סוגים אחרים של תרבויות organoid ללמוד חילוף החומרים השומנים בסוגי תאים אחרים.
ההתמהמה תלויה במידה ניכרת בצפיפות התרבות האורגנואידית. נסו להבטיח צפיפות אורגנואידית עקבית בין דגימות וניסויים. הדגמה חזותית של בדיקה זו היא קריטית משום שחשוב להראות כיצד האורגנואיד צריך להיות מתורבת וכיצד יש לטפל בהם כדי להבטיח ניתוח נכון של היווצרות טיפת השומנים.
לאחר הכנת האורגנואידים, שאף בזהירות את מדיום התרבות מבלי להפריע ל טיפות מטריצת קרום המרתף. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מדיום בסיס קר ל הבאר הראשונה של אורגנואידים. באמצעות פיפטה P1000, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את טיפות מטריצת קרום המרתף עם אורגנואידים.
חזור על הליכים אלה עם אותו מדיום הבא גם נדרש, אבל לא לקצור יותר משתי בארות לכל 500 microliters של מדיום בסיס. לאסוף את האורגנואידים בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר מחייב נמוך, ולסובב אותם למטה בצנטריפוגה שולחן מיני במשך 15 עד 20 שניות. הוסיפו 400 מיקרוליטרים של טריפסין לאורגנואידים המסובבים.
דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש פיפטה P200 כדי pipette בעדינות את ההשעיה למעלה ולמטה כדי לשבש את הצבירה הנותרת של תאים. דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
כאשר רק תאים בודדים נשארים, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום בסיס ומסובבים כלפי מטה את התאים בצנטריפוגה קטנה לשולחן למשך 15 עד 20 שניות. שאף את העל-טבעי לחלוטין. השתמשו בפיפט P200 כדי להשעות מחדש את התאים הבודדים ב-200 מיקרוליטרים של hSI-EM טרי, ולהוסיף 800 מיקרוליטרים נוספים של hSI-EM.
לאחר מכן ספור את מספר התאים בהשעיה וחשב את נפח התאים הדרוש לצפיפות התאים הסופית. מוציאים את נפח המתלים המתאים ומתאימים את הצפיפות ל-750 תאים למיקרוליטר. הוסף מטריצת קרום מרתף לתליית התא ביחס של 2 ל-1.
בעדינות pipette ההשעיה לערבב להיות זהיר כדי למנוע יצירת בועות. בצלחת תרבות מחוממת מראש, זרע את שלוש טיפות 10 מיקרוליטר לגם אם הצלחת יש 24 בארות או טיפה אחת חמישה מיקרוליטר לגם אם הצלחת יש 96 בארות. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך 10 עד 15 דקות כדי לחזק את טיפות.
בינתיים, מחממים מראש נפח מתאים של hSI-EM+Y באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו בזהירות את hSI-EM+Y החם מראש לכל באר של הצלחת. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני.
לאחר יומיים עד שלושה ימים, החלף את המדיום ב- hSI-EM ודאג לרענן אותו פעמיים עד שלוש פעמים בשבוע. ראשית, לשקול 0.2 גרם של חומצה אולאית נוזלית בטמפרטורת החדר. מוסיפים 1.5 מיליליטר של PBS סטרילי ברמה תרבותית ומחממים את התערובת ל-70 מעלות צלזיוס למשך שעה ומוודאים מערבולת לסירוגין.
לאחר מכן, לשקול 5.89 גרם של BSA ללא חומצות שומן ולהמיס אותו 33.9 מיליליטר של PBS. מחממים את התערובת באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס עד להמסה מלאה של ה-BSA. Vortex תערובת חומצה אולאית שוב כדי ליצור אמולסיה של טיפות בסדר מיד להוסיף אותו לפתרון BSA באמצעות פיפטה זכוכית.
שומרים את התערובת על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד פתרון צהבהב ברור נשאר. מעבר האורגנואידים כפי שתואר בעבר וזרע את התאים הבודדים שמקורם באורגנואידים לתוך צלחת שחורה ברורה 96 באר. ביום השישי של culturing על hSI-EM, להחליף את מדיום התרבות עם hSI-EM המכיל מילימול אחד של חומצה אולאית BSA מצומד.
דגירה התאים במשך 16 עד 17 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות או היעדר 0.1 מעכבי DGAT1 מיקרומולרי. לאחר מכן, שאף את המדיום מבלי להפריע טיפות מטריצת קרום המרתף. לקבע את האורגנואידים על ידי הוספת 100 microliters של ארבעה אחוז ניטרלי מאגר פורמלדהיד ל בארות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
הסר את פורמלדהיד בעדינות ובזהירות לשטוף את התאים עם 150 microliters של PBS ל הבאר. להכתים את התאים עבור טיפות השומנים עם 025 מיליגרם למיליליטר LD540 ו DAPI ב PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. ואז לשטוף את הבארים בזהירות עם PBS.
לתמונות סקירה של אורגנואידים שלמים יש להשתמש בסובייקטיבי פי 40 שמתאים להדמיה פלואורסצנטית קונפוקל. הגדר את המיקרוסקופ לתמונה עבור DAPI וצבע LD540 באמצעות הגדרות העירור וההפחתה המוצגות כאן. הגדר את גודל חור הסיכה ליחידה אווריורית אחת לקבלת רזולוציה מספקת של ציר z.
כדי לדמיין חצי של אורגנואיד כדורי להגדיר z-מחסנית כ 85 מיקרומטר. באמצעות מערכת עיבוד תמונה מתאימה, שנה את ערימת z של כל אורגנואיד להקרנה מרבית על-ידי לחיצה על תמונה, ערימות, פרוייקט Z. הגדר את סף ההקרנה המרבית לרמה שבה אין אות LD540 גלוי בדגימה של בקרת רכב BSA על-ידי לחיצה על תמונה, כוונון, סף.
השתמש בהגדרות אלה כדי לסף כל תמונה. לאחר מכן למדוד את השטח הכולל של פלואורסצנטיות עבור כל הקרנה מקסימלית באמצעות הפונקציה לנתח, לנתח חלקיקים. לניתוח נכון של היווצרות טיפת השומנים, האורגנואידים לא צריכים להיות זרע בצפיפות מדי לפני גירוי עם חומצה אולאית וכתמים הבאים.
זה חשוב במיוחד עבור הקריאה קונפוקל קורא צלחת מאז אורגנואידים חופפים עלול להפריע פלואורסצנטיות. לאחר גירוי עם מילימולר אחד של חומצה אולאית בן לילה, היווצרות טיפת השומנים ניתן לדמיין עם מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך. הצטברות של טיפות שומנים מפזרת אור מועבר, ולכן האורגנואידים נראים כהים יותר, ואילו אורגנואידים שאינם מגורים יש מראה שקוף.
לאחר האורגנואידים המושרים בחומצה אולאית קבועים ומוכתמים, ניתן לדמיין את היווצרות טיפת השומנים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל. מכיוון שהאברנואידים הם מבנים תלת-מימדיים, מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי רגיל אינו מתאים בשל אות הרקע מחוץ לפוקוס, ולכן נעשה שימוש בערימה קונפוקלית כדי לאפיין LDF באורגנואידים. כימות של דגימות מיקרוסקופיה confocal יכול להתבצע גם באמצעות קורא לוח פלואורסצנטי מנורמל לאות Hoechst פלואורסצנטי.
מסמן קורא הלוחות מצביע על ירידה משמעותית באות LD540 בתאי אורגנואידים שטופלו במעכב DGAT1 בהשוואה לאורגנואידים לא מטופלים. כימות של היווצרות LD בתאים בודדים ניתן להשיג באמצעות ציטומטר זרימה. אסטרטגיית הגתה המוצגת כאן היא לאיברואידים מעיים אנושיים נותק.
היסטוגרמות נציג עבור שניהם SSC-A ואת האות LD540 של אוכלוסיית התא החי הסופי להראות כי היווצרות טיפת השומנים יגרום לעלייה SSC-A עקב היווצרות של טיפות שומנים תאיים. בנוסף, כתמי LD540 עבור שומנים המאוחסנים טיפות השומנים, ואת האות גם יגדל עם אינדוקציה של היווצרות טיפת השומנים. ככזה, היווצרות טיפת השומנים נמדדת כשינוי בעוצמת הפלואורסצנט הממוצעת של SSC-A ו- LD540.
הצעדים המכריעים ביותר של פרוטוקול זה הם התרבות של אורגנואידים מעיים אנושיים ואת גלית נכונה של חומצה אולאית ל- BSA. כדי להתאים לתנאים נוספים, ניתן לנתח את ההתראה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי. כדי לתקן עבור מספר האורגנואיד ל באר, אות LD540 היה מנורמל לאות DAPI.
בעזרת טכניקה זו, חוקרים יכולים לחקור היווצרות טיפות שומנים במערכות אורגנואידיות, ולשפר טכניקות ניתוח שונות כגון מיקרוסקופ אלקטרונים כדי לאמת את הממצאים שלהם.
