人类肠道器官脂滴形成特征化和定量的荧光测定

本协议介绍了一些量化人类肠道器官中脂滴形成的方法。它可以用作高通量筛选平台，以测试调节脂滴形成的药物。我们描述的方法是基于脂滴特异性染料和活检衍生的肠道器官。

因此，它为脂滴的形成提供了一个稳定、准确和生理相关的模型。该协议可用于筛选患者特有的新药候选者，这些候选药物可调节脂滴的形成，例如，在DGAT1缺陷患者中。这种脂滴形成测定也可以应用于其他类型的器官培养物，以研究其他细胞类型的脂质代谢。

测定在很大程度上取决于器官培养的密度。努力确保样品和实验的有机体密度一致。这种测定的视觉演示至关重要，因为展示应如何培养器官以及如何处理器官以确保对脂滴形成进行正确分析非常重要。

制备器官后，小心吸气培养基，而不干扰地下室膜基质的液滴。在有机体的第一井中加入500微升的冷基底介质。使用 P1000 移液器，上下轻轻移液器，用有机体破坏地下室膜基质液滴。

在下一个和要求中使用相同的介质重复此程序，但每 500 微升基基介质中收获不超过两口井。在低结合的1.5毫升微离心管中收集器官，并在迷你台式离心机中旋转15至20秒。在旋转的器官中加入400微升的尝试素。

在37摄氏度的水浴中孵育5分钟。接下来，使用P200移液器轻轻移液，上下移液，以扰乱细胞的剩余聚集体。在37摄氏度的水浴中孵育5分钟。

当仅保留单个细胞时，添加一毫升基底介质，并在微型桌面离心机中旋转细胞 15 到 20 秒。完全吸上一道。使用 P200 移液器在 200 微升新鲜 hSI-EM 中重新悬浮单个细胞，并添加另外 800 微升的 hSI-EM。

然后计算悬浮细胞的数量，并计算最终细胞密度所需的细胞体积。拿出适当的悬浮量，将密度调整到每微升750个细胞。以二比一的比例将基底膜基质添加到细胞悬浮液中。

轻轻移液吊架混合，小心避免产生气泡。在预热培养板中，如果该钢板有 24 孔或每孔有 96 孔，则每孔播种三个 10 微升液滴。将板放在37摄氏度的培养箱中，用5%的二氧化碳放置10至15分钟，以凝固液滴。

同时，在37摄氏度的水浴中预热适当体积的hSI-EM+Y。在此之后，请小心地将预热的 hSI-EM+Y 添加到板的每个井中。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞。

两到三天后，用 hSI-EM 替换介质，并确保每周刷新两到三次。首先，在室温下重0.2克液态油酸。加入1.5毫升培养级无菌PBS，将混合物加热至70摄氏度一小时，确保间歇性涡旋。

接下来，重5.89克无脂肪酸BSA，溶解在33.9毫升PBS中。在37摄氏度的水浴中加热混合物，直到BSA完全溶解。再次对油酸混合物进行涡流，形成细滴乳液，并立即使用玻璃移液器将其添加到 BSA 溶液中。

将混合物保持在37摄氏度，30分钟，直到一个清晰的黄色溶液仍然存在。通过前面描述的器官，将器官衍生的单细胞播种成黑色清底96井板。在hSI-EM的栽培第六天，用含有一毫摩尔的油酸和BSA结合的hSI-EM取代培养基。

在0.1微摩尔DGAT1抑制剂存在或不存在的情况下，在37摄氏度下孵育细胞16至17小时。在此之后，吸气介质而不干扰地下室膜基质液滴。在室温下，在井中加入100微升4%中性缓冲甲醛，将30分钟固定在井中， 固定器官。

轻轻去除甲醛，用每井150微升PBS小心清洗细胞。将脂质液滴的细胞在PBS中用每毫升025毫克LD540和DAPI染色15分钟，在黑暗中室温下。然后用 PBS 小心地清洗水井。

对于整个器官的概述图像，使用 40 倍主观适合共生荧光成像。使用此处显示的激发和发射设置将显微镜设置为 DAPI 和 LD540 染料的图像。将针孔大小设置为一个通风单元，以获得足够的 z 轴分辨率。

要成像球形器官的一半，将 z 堆栈设置为大约 85 微米。使用适当的图像处理系统，通过单击"图像、堆栈、Z 项目"，将每个器官的 z 堆栈转换为最大投影。通过单击"图像、调整"、阈值，将最大投影的阈值设置为 BSA 车辆控制样本中看不到 LD540 信号的水平。

使用这些设置对每个图像进行阈值。然后使用"分析、分析粒子"功能测量每个最大投影的荧光总面积。为了正确分析脂滴的形成，在用油酸和随后的染色刺激之前，不应将有机体播种得太密集。

这对于共和器和板读器读出尤其重要，因为重叠的器官可能会干扰荧光。在用一毫摩尔酸过夜刺激后，可以使用倒置的亮场显微镜进行脂质液滴的形成。脂滴的积累散射透射光，因此器官看起来更暗，而非刺激的器官具有半透明的外观。

一旦油酸刺激的有机体被固定和染色，脂液滴的形成可以使用共和显微镜可视化。由于器官是3D结构，由于对焦背景信号外，常规荧光显微镜不适合使用，因此使用共聚焦z堆栈来描述器官中的LDF。还可以使用荧光板读卡器对荧光霍赫斯特信号进行共和显微镜样品的定量。

板读卡器测定表明，与未经治疗的器官类相比，使用DGAT1抑制剂治疗的器官细胞中的LD540信号显著减少。利用流动细胞计可以实现单个细胞LD形成量。此处所示的浇注策略是分离的人类肠道器官。

SSC-A 和最终活细胞群体LD540信号的代表性直方图表明，由于细胞内脂液滴的形成，脂滴的形成将导致SSC-A的增加。此外，LD540污渍储存在脂质液滴中，信号也会在脂滴形成诱导时增加。因此，脂滴的形成被测量为 SSC-A 和 LD540 平均荧光强度的变化。

该协议最关键的步骤是人体肠道有机体培养和油酸对BSA的适当波纹。为了适应更多的条件，可以使用荧光板读卡器分析此测定方法。为了纠正每井的风化数，LD540信号被规范化为DAPI信号。

通过这项技术，研究人员可以研究器官系统中的脂液滴的形成，并改进电子显微镜等各种分析技术，以验证他们的发现。