Этот протокол позволяет исследователю определить мутантные морские анемоны во время раннего эмбриогенеза, так что постэмбриональный фенотип развития может быть проанализирован. Основным преимуществом этого метода является то, что он может быть использован для генотипа отдельных морских анемонов в начале онтогении без ущерба для жизни животного. Демонстрацией этой процедуры будет Мигель Сильва, аспирант моей лаборатории.
За день до индукции нереста поместите анемон нематостелла vectensis в температуру и свет контролируемых инкубатор, программирование инкубатора так, что животные подвергаются воздействию восьми часов света при температуре 25 градусов по Цельсию. На следующий день, удалить животных из инкубатора и оставить их на скамейке верхней при комнатной температуре со светом, чтобы нерест, который будет происходить в течение следующих полутора-двух часов. Используйте перенесите пипетку, наконечник которой разрезается, чтобы увеличить отверстие, чтобы поместить пакеты яйцеклеток из женского контейнера в сперматозоиды, содержащие мужской контейнер, и оставить их в мужском контейнере, по крайней мере 15 минут, чтобы обеспечить оплодотворение.
После оплодотворения, чтобы dejelly яичные пакеты, поместите их в морскую воду, содержащую 3%cysteine на стеклянной чашке Петри и осторожно агитировать на шейкер в течение 12 минут. Затем разбить комки с пластиковой пипеткой и продолжать агитировать еще две-три минуты, пока полностью dejellied. Держите оплодотворенные яйца на том же блюде при температуре 16 градусов по Цельсию или при комнатной температуре.
На следующий день подготовь буфер извлечения ДНК, описанный в рукописи, хорошо перемешивайте вихрем и вбив его в ПЦР-трубки, добавляя по 20 микролитров к каждой трубке. Растворите 1%agarose в морской воде, залить его в чашку Петри, чтобы покрыть дно, и охладить на скамейке сверху, чтобы сделать гель кровать. Обложка гель кровать со свежей морской водой.
Передача 24-часовых эмбрионов после оплодотворения с помощью пипетки в агарозный гель, содержащий чашку Петри. Вставьте вольфрамовую иглу в держатель необходимости и стерилизовать, окунув его кончик в алкоголь и поместив его в пламя, чтобы сжечь алкоголь. Под рассечением микроскопа, сделать депрессию на агарозе с помощью вольфрама иглы, чтобы удалить кусок поверхности агарозы размером с эмбрион, чтобы манипулировать.
Затем, используя вольфрамовую иглу, поместите эмбрион в депрессию с боковой стороной лицом вниз, чтобы ограничить движение эмбриона для микрохирургии. Для того, чтобы выполнить успешную операцию, крайне важно ограничить движение эмбриона. С помощью вольфрамовой иглы хирургическим путем удалите кусок аборигенной ткани вдоль оси перорального аборала, расположенной напротив перорального бластопорального отверстия.
С помощью P20 пипетки перенесите изолированную аборигенную ткань в ПЦР-трубку, содержащую 20 микролитров буфера извлечения ДНК. Перенесите послеоперационный эмбрион в колодец из 24-хорошо пластины, содержащей не менее 500 микролитров пресной морской воды. И поместите пластину, содержащую послеоперационные эмбрионы, в инкубатор при 16 градусах цельсия до завершения генотипирования.
Чтобы извлечь геномную ДНК из одиночных эмбрионов, сначала кратко вращайте ПЦР-трубки, содержащие буфер извлечения ДНК и изолированные эмбриональные ткани с помощью мини-центрифуги. Затем инкубировать трубки при 55 градусах по Цельсию в течение трех часов в то время как вихри в течение 30 секунд каждые 30 минут, чтобы обеспечить распад клеток сгустки и повышения лиза клеток. После инактивации протеиназы K при 95 градусах по Цельсию в течение четырех минут, создали реакцию ПЦР, используя извлеченную геномную ДНК в качестве шаблона для усиления локуса интереса.
Дизайн желаемых грунтовок, как описано в рукописи. Настройка 20 микролитров ПЦР реакции. После завершения ПЦР, запустить агарозный гель электрофорез, чтобы определить размер и наличие или отсутствие продуктов ПЦР, убедившись, что настроить состояние агароза гель электрофорез в зависимости от ожидаемого размера продуктов ПЦР.
Используйте результаты ПЦР в отношении размера и присутствия или отсутствия или ПЦР продуктов для присвоения генотипа каждому послеоперационному эмбриону, а затем сортировать эмбрионы в соответствии с их генотипом. Геном нематостеллы имеет один локус, который кодирует белок-предшественник нейропептида, GLWamide. Ранее сообщалось о трех нокаут-мутантных аллелях на локусе.
ПЦР результаты случайно отобранных эмбрионов среди потомства F1 крест между одной гетерозиготной женщины проведения нокаут аллель и гетерозиготных мужчин проведения C нокаут аллель показать различные генотипы. Эмбрионы один и два показывают одну ПЦР-группу, соответствующую ожидаемого размера аллеля нокаута. Эмбрионы три и шесть показывают две группы ПЦР с ожидаемыми размерами для нокаута аллели А и C.Embryos четыре, семь, и восемь показывают одну группу ПЦР, соответствующие ожидаемого размера C нокаут аллель.
Embryo 5 не показывает полос, что свидетельствует об отсутствии связывания грунтовки. Чтобы исключить возможность геномного отказа извлечения ДНК, другой ПЦР был запущен с использованием обратного грунтовки, которая может связываться с дикой последовательности типа. В тех случаях, когда был обнаружен продукт ПЦР ожидаемого размера, геномная экстракция ДНК была успешной.
В то время как ни один продукт не предложил сбой в извлечении. Хотя этот протокол предназначен для эмбрионов морского анемона, он, несомненно, можно применить этот метод к другим книдарянам, таким как кораллы и медузы, где геномная информация и эмбрионы доступны. После этой процедуры, выявленные мутанты используются для оценки фенотипа развития.
Например, гистологические методы, такие как иммуностимунизация могут быть использованы для оценки дефектов в морфологии, в то время как на месте гибридизации, в режиме реального времени количественные RT-PCR, и РНК-сек могут быть использованы для оценки дефектов в экспрессии генов. Кроме того, живая визуализация может быть использована для оценки дефектов в поведении во время пост-эмбрионального развития, например, у личинок или в ранних полипах.
