Este protocolo permite a un investigador identificar anémonas de mar mutantes durante la embriogénesis temprana para que se pueda analizar el fenotipo post-embrionario del desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para genotipo de anémonas de mar individuales al principio de la ontogenia sin sacrificar la vida del animal. Demostrar este procedimiento estará Miguel Silva, un estudiante graduado de mi laboratorio.
El día antes de la inducción de desove, coloque la anémona nematostella vectensis en una incubadora controlada por temperatura y luz, programando la incubadora para que los animales estén expuestos a ocho horas de luz a 25 grados centígrados. Al día siguiente, retire los animales de la incubadora y déjelos en una mesa de sobremesa a temperatura ambiente con la luz encendida para permitir el desove, que ocurrirá dentro de la siguiente y media a dos horas. Use una pipeta de transferencia que se corta la punta para agrandar la abertura y colocar los paquetes de óvulos del recipiente femenino en un recipiente macho que contenga espermatozoides y dejarlos en el recipiente masculino durante al menos 15 minutos para permitir la fertilización.
Después de la fertilización, para dejarlly los paquetes de huevos, colóquelos en agua de mar que contiene 3% de cisteína en un plato de Petri de vidrio y agitar suavemente en una coctelera durante 12 minutos. A continuación, romper los grumos con una pipeta de plástico y seguir agitando durante otros dos a tres minutos hasta que se deje completamente. Mantenga los huevos fertilizados en el mismo plato a 16 grados centígrados o a temperatura ambiente.
Al día siguiente, prepare el tampón de extracción de ADN como se describe en el manuscrito, mezcle bien por vórtice y aliquotlo en tubos de PCR añadiendo 20 microlitros a cada tubo. Disolver 1% de agarosa en agua de mar, verter en un plato de Petri para cubrir la parte inferior, y enfriar en una parte superior de banco para hacer un lecho de gel. Cubra el lecho de gel con agua de mar fresca.
Transfiera embriones post-fertilización las 24 horas utilizando una pipeta en el plato Petri que contiene el lecho de gel de agarosa. Inserte una aguja de tungsteno en un soporte de necesidad y esterilizar sumergiendo su punta en alcohol y colocándola en llamas para quemar el alcohol. Bajo un microscopio diseccionado, haz una depresión en la agarosa usando la aguja de tungsteno para extraer un pedazo de agarosa superficial del tamaño de un embrión que se va a manipular.
A continuación, utilizando la aguja de tungsteno, coloque el embrión en la depresión con su lado lateral hacia abajo con el fin de restringir el movimiento del embrión para la microcirugía. Para realizar una cirugía exitosa, es fundamental restringir el movimiento del embrión. Con la aguja de tungsteno, retire quirúrgicamente un pedazo de tejido aboral a lo largo del eje aboral oral, situado frente a la abertura blastoporal oral.
Con una pipeta P20, transfiera el tejido aboral aislado a un tubo pcR que contenga 20 microlitros de tampón de extracción de ADN. Transfiera el embrión post-cirugía en un pozo de una placa de 24 pozos que contenga al menos 500 microlitros de agua de mar fresca. Y coloque la placa que contiene embriones post-cirugía en una incubadora a 16 grados Celsius hasta que se complete el genotipado.
Para extraer ADN genómico de embriones individuales, primero gire brevemente por los tubos de PCR que contienen el tampón de extracción de ADN y los tejidos embrionarios aislados utilizando una mini centrífuga. Luego incubar los tubos a 55 grados Celsius durante tres horas mientras vórtice durante 30 segundos cada 30 minutos para asegurar la ruptura de los grumos celulares y mejorar la lelisis celular. Después de inactivar la proteinasa K a 95 grados Celsius durante cuatro minutos, configure una reacción PCR utilizando ADN genómico extraído como plantilla para amplificar el locus de interés.
Diseñe las imprimaciones deseadas como se describe en el manuscrito. Configure una reacción PCR de 20 microlitros. Después de completar la PCR, ejecutar la electroforesis de gel de agarosa para determinar el tamaño y la presencia o ausencia de productos pcR, asegurándose de ajustar el estado de la electroforesis de gel de agarosa dependiendo del tamaño esperado de los productos de PCR.
Utilice los resultados de la PCR con respecto al tamaño y la presencia o ausencia o los productos de PCR para asignar un genotipo a cada embrión postquirúrgico y luego clasificar los embriones según su genotipo. El genoma de la nematostella tiene un solo locus que codifica una proteína precursora para el neuropéptido, GLWamida. Tres alelos mutantes noqueantes en el locus han sido reportados previamente.
La PCR es el resultado de embriones muestreados aleatoriamente entre la progenie de un cruce de F1 entre una hembra heterocigota que lleva un alelo noqueador A y los machos heterocigotos que llevan un alelo C knockout muestran diferentes genotipos. Los embriones uno y dos muestran una sola banda de PCR correspondiente al tamaño esperado de A knockout allele. Embryos tres y seis muestran dos bandas de PCR con los tamaños esperados para alelos noqueados A y C.Embryos cuatro, siete y ocho muestran una sola banda de PCR correspondiente al tamaño esperado de alelo C knockout.
Embryo 5 no muestra bandas, lo que sugiere la falta de unión de imprimación. Para descartar la posibilidad de fallo genómico de extracción de ADN, se ejecutó otra PCR utilizando una imprimación inversa que puede unirse a la secuencia de tipo salvaje. Cuando se detectó un producto de PCR de un tamaño esperado, la extracción de ADN genómico tuvo éxito.
Mientras que ningún producto sugirió un fallo en la extracción. Aunque este protocolo está diseñado para embriones de anémonas de mar, seguro que es posible aplicar este método a otros cnidarios, como corales y medusas, donde la información genómica y los embriones son accesibles. Después de este procedimiento, los mutantes identificados se utilizan para evaluar el fenotipo del desarrollo.
Por ejemplo, las técnicas histológicas como la inmunostaining se pueden utilizar para evaluar defectos en la morfología, mientras que la hibridación in situ, la RT-PCR cuantitativa en tiempo real y el ARN-seq se pueden utilizar para evaluar defectos en la expresión génica. Además, las imágenes en vivo se pueden utilizar para evaluar defectos en el comportamiento durante el desarrollo post-embrionario, como en larvas o en pólipos tempranos.
