早期开发期间海葵基因分型

该协议使研究人员能够在早期胚胎形成过程中识别突变海葵，以便分析胚胎后发育表型。这项技术的主要优点是，它可以用来基因型个别海葵早期在基因上不牺牲动物的生命。演示这个程序的将是米格尔·席尔瓦，一个研究生从我的实验室。

在产卵诱导前一天，将海葵线虫菌体放在温度和光控制的孵化器中，对孵化器进行编程，使动物在25摄氏度下暴露在8小时的光线下。第二天，将动物从孵化器中取出，在室温下放在长椅上，并亮着灯，以便产卵，这一点将在一个半小时到两个小时内发生。使用转移移液器谁的尖端被削减扩大开口，将卵子包从女性容器放入一个含有精子的男性容器，并留在男性容器中至少15分钟，以允许受精。

受精后，将鸡蛋包装去掉，将它们放在含有3%半胱氨酸的海水中，放在一个玻璃培养皿上，轻轻搅拌12分钟。然后用塑料移液器分解团块，继续搅拌两到三分钟，直到完全脱液。将受精卵放在同一盘中16摄氏度或室温下。

第二天，准备手稿中描述的DNA提取缓冲液，通过涡流混合，通过向每个管中加入20微升，将其加入PCR管中。在海水中溶解1%的加糖，倒入培养皿中盖底，并在长凳上冷却，制作凝胶床。用新鲜的海水盖住凝胶床。

使用移液器将 24 小时受精后胚胎移植到含有 agarose 凝胶床的培养皿中。将钨针插入需要支架中，将其尖端浸入酒精中并放入火焰中以烧掉酒精，进行消毒。在解剖显微镜下，使用钨针去除一块大约纵的胚胎大小的表面红玫瑰，在红糖上制造凹陷。

然后，使用钨针，将胚胎放入凹陷中，其侧朝下，以限制胚胎进行显微手术的运动。为了进行成功的手术，限制胚胎的运动至关重要。用钨针，手术切除一块外阴组织沿口腔外阴轴，位于对面的口腔喷口。

使用P20移液器，将分离的外皮组织转移到含有20微升DNA提取缓冲液的PCR管中。将手术后胚胎转移到含有至少500微升新鲜海水的24井板井中。将含有手术后胚胎的盘子放在16摄氏度的培养箱中，直到基因分型完成。

要从单个胚胎中提取基因组DNA，首先使用微型离心机短暂地旋转含有DNA提取缓冲液和分离胚胎组织的PCR管。然后在55摄氏度下孵育管子3小时，每30分钟旋转30秒，以确保细胞团的破裂，增强细胞解。在95摄氏度下解活蛋白酶K4分钟后，利用提取的基因组DNA作为模板建立PCR反应，以放大感兴趣的位置。

设计手稿中描述的所需底像。设置 20 微升 PCR 反应。完成PCR后，运行红糖凝胶电泳以确定PCR产品的大小和存在或不存在，确保根据PCR产品的预期尺寸调整红糖凝胶电泳的状态。

使用有关大小和存在或不存在或PCR产品PCR结果为每个手术后胚胎分配基因型，然后根据胚胎的基因型对胚胎进行排序。线虫基因组有一个位点，编码神经肽GLWamide的前体蛋白。之前曾报道过该地位有三个敲除突变等位基因。

PCR结果从随机采样的胚胎之间的一个异质异质女性携带一个淘汰等位基因和异质雄性携带C敲除等位基因之间的后代显示不同的基因类型。胚胎一和二显示一个PCR波段对应预期大小的淘汰等位基因。胚胎三和六显示两个PCR波段与淘汰等位基因A和C.Embryos四，七和八显示一个PCR波段对应C淘汰等位基因的预期大小。

胚胎 5 显示没有带， 表明缺乏底像结合。为了排除基因组DNA提取失败的可能性，使用反向底转运行另一个PCR，该底转可以绑定到野生类型序列。如果检测到预期大小的PCR产品，基因组DNA提取是成功的。

而没有产品表明提取失败。虽然该协议是为海葵胚胎设计的，但肯定有可能将这种方法应用于其他人类，如珊瑚和水母，在那里可以获取基因组信息和胚胎。按照这个程序，识别的突变体用于评估发育表型。

例如，组织学技术，如免疫污染可用于评估形态缺陷，而原位杂交，实时定量RT-PCR和RNA-seq可用于评估基因表达的缺陷。此外，活成像可用于评估胚胎后发育过程中的行为缺陷，如幼虫或早期息肉。