הגנוזות של כלנית ימית במהלך ההתפתחות המוקדמת

פרוטוקול זה מאפשר לחוקר לזהות כלניות ים מוטנטיות במהלך העוברים המוקדמים, כך שניתן יהיה לנתח פנוטיפ התפתחותי פוסט-עוברי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי גנוטיפ כלניות ים בודדות בשלב מוקדם של ontogeny מבלי להקריב את חייו של החיה. הוכחת הליך זה יהיה מיגל סילבה, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.

ביום שלפני השראת אינדוקציה, מניחים את הנמאטוסטלה וקטנסיס הכלית באינקובטור מבוקר טמפרטורה ואור, מתכנתים את החממה כך שבעלי החיים נחשפים לשמונה שעות אור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. למחרת, מוציאים את בעלי החיים מהחמה ומשאירים אותם על ספסל עליון בטמפרטורת החדר כשהאור דול כדי לאפשר השרצאה, שתתרחש בתוך שעה וחצי עד שעתיים. השתמש פיפטה העברה מי קצה נחתך כדי להגדיל את הפתח כדי למקם חבילות ביצה מן המיכל הנשי לתוך מיכל זכר המכיל זרע ולהשאיר אותם במיכל הגברי לפחות 15 דקות כדי לאפשר הפריה.

לאחר ההפריה, כדי dejelly את חבילות הביציות, מניחים אותם במי ים המכילים 3% ציסטאין על צלחת פטרי זכוכית בעדינות להתסיס על שייקר במשך 12 דקות. ואז לשבור גושים עם פיפטה פלסטיק ולהמשיך להתסיס עוד שתיים עד שלוש דקות עד dejellied לחלוטין. שומרים את הביציות המופריות על אותה מנה בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר.

ביום שלמחרת, הכינו את מאגר שאיבת הדנ"א כמתואר בכתב היד, ערבבו היטב על ידי מערבולת, והגדילו אותו לצינורות PCR על ידי הוספת 20 מיקרוליטרים לכל צינור. ממיסים 1% במים, יוצקים אותו לתוך צלחת פטרי כדי לכסות את התחתית, ומצננים על ספסל עליון כדי להכין מיטת ג'ל. מכסים את מיטת הג'ל במי ים מתוקים.

מעבירים עוברים 24 שעות ביממה לאחר ההפריה באמצעות פיפטה לתוך צלחת פטרי המכילה ג'ל אגרוז. הכנס מחט טונגסטן לתוך בעל צורך וחיטוי על ידי טבילת הקצה שלה באלכוהול והנחת אותו בלהבה כדי לשרוף את האלכוהול. תחת מיקרוסקופ לנתח, לעשות דיכאון על agarose באמצעות מחט טונגסטן כדי להסיר חתיכת משטח התעוררה בערך בגודל של עובר להיות מניפולציה.

לאחר מכן, באמצעות מחט טונגסטן, למקם את העובר לתוך הדיכאון עם הצד הצדדי שלה פונה כלפי מטה על מנת להגביל את התנועה של העובר עבור מיקרוכירורגיה. על מנת לבצע ניתוח מוצלח, חיוני להגביל את תנועת העובר. עם מחט טונגסטן, להסיר בניתוח חתיכת רקמה aboral לאורך הציר aboral אוראלי, הממוקם מול פתח blastoporal אוראלי.

עם פיפטה P20, להעביר את הרקמה aboral מבודד לצינור PCR המכיל 20 microliters של מאגר מיצוי DNA. מעבירים את העובר שלאחר הניתוח לתוך באר של צלחת 24 באר המכילה לפחות 500 מיקרוליטרים של מי ים מתוקים. ומ מניחים את הצלחת המכילה עוברים לאחר הניתוח באינקובטור ב 16 מעלות צלזיוס עד genotyping הושלם.

כדי לחלץ דנ"א גנומי עוברים בודדים, תחילה לסובב בקצרה את צינורות PCR המכילים את מאגר מיצוי ה- DNA ורקמות עובריות מבודדות באמצעות מיני צנטריפוגה. לאחר מכן דגירה הצינורות ב 55 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות תוך מערבולת במשך 30 שניות כל 30 דקות כדי להבטיח פרידה של גושים התא ולשפר את תות התא. לאחר השבתת פרוטאינאז K ב 95 מעלות צלזיוס במשך ארבע דקות, להגדיר תגובת PCR באמצעות DNA גנומי שחולצו כתבנית כדי להגביר את הפוקוס של עניין.

העיצוב רצה פריימרים כמתואר בכתב היד. הגדר תגובת PCR של 20 מיקרוליטר. לאחר השלמת PCR, להפעיל אלקטרופורזה ג'ל agarose כדי לקבוע את הגודל והנוכחות או היעדר של מוצרי PCR, הקפדה להתאים את המצב של אלקטרופורזה ג'ל agarose בהתאם לגודל הצפוי של מוצרי PCR.

השתמש בתוצאות PCR לגבי גודל ונוכחות או היעדרות או מוצרי PCR כדי להקצות גנוטיפ לכל עובר לאחר הניתוח ולאחר מכן למיין עוברים על פי הגנוטיפ שלהם. הגנום nematostella יש לוקוס יחיד המקודד חלבון מבשר עבור נוירופפטיד, GLWamide. שלושה אללים מוטנטים נוקאאוט על הלוקוס דווחו בעבר.

PCR נובע עוברים שנדגמו באופן אקראי בין צאצאים של צלב F1 בין נקבה הטרוזיגוס אחת נושאת אלל נוקאאוט זכרים הטרוזיגים הנושאים אלל נוקאאוט C להראות גנוטיפים שונים. עוברים 1 ו-2 מציגים רצועת PCR אחת המתאימה לגודל הצפוי של אלל נוקאאוט. עוברים שלוש ושש להראות שתי להקות PCR עם הגדלים הצפויים עבור אללים נוקאאוט A ו- C.Embryos ארבע, שבע, ושמונה להראות להקה אחת PCR המתאים לגודל הצפוי של אלל נוקאאוט C.

עובר 5 לא מראה להקות, מה שמרמז על היעדר כריכת פריימר. כדי לשלול את האפשרות של כשל מיצוי DNA גנומי, PCR אחר היה לרוץ באמצעות פריימר הפוך שיכול להיקשר לרצף סוג פראי. כאשר מוצר PCR בגודל צפוי זוהה, מיצוי DNA גנומי היה מוצלח.

בעוד שאף מוצר לא הציע כשל בחילוץ. למרות פרוטוקול זה מיועד לעוברים כלנית הים, זה בטוח ניתן ליישם שיטה זו על cnidarians אחרים, כגון אלמוגים מדוזה, שם מידע גנומי ועוברים נגישים. בעקבות הליך זה, המוטנטים שזוהו משמשים להערכת פנוטיפ התפתחותי.

לדוגמה, טכניקות היסטולוגיות כגון immunostaining ניתן להשתמש כדי להעריך פגמים במורפולוגיה, בעוד היברידיזציה situ, כמותי בזמן אמת RT-PCR, ו RNA-seq יכול לשמש כדי להעריך פגמים בביטוי גנים. כמו כן, הדמיה חיה יכולה לשמש להערכת פגמים בהתנהגות במהלך התפתחות פוסט-עוברית, כגון בזחלים או בפוליפים מוקדמים.