Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы вирусологии гепатита В, такие как поиск клеточных или вирусологических факторов, влияющих на интеграцию ДНК ВПЧ. Эта методика имеет множество преимуществ. Это относительно дешево, и легко провести, анализ результатов прост, и это очень чувствительно, вплоть до отдельных копий.
Хотя этот метод может быть использован для получения информации об интеграции HBV, он также может быть использован для других вирусов, которые интегрируются в геном клетки-хозяина, такие как ВИЧ, HTLV-1, или ВПЧ. Чтобы заразить клетки, семя 200 000 клеток на миллилитр в двенадцати хорошо пластины, с 1 миллилитр D-mem. На следующий день используйте колонку гепарина, очищенную су-за-на-дин из HEP-AD 38, как инокулентную, чтобы заразить клетки по 1000 VGE на клетку, в 500 микролитров среды культуры.
Затем, культура клеток на 37 градусов по Цельсию. Затем, на следующий день, мыть клетки в два раза с одним миллилитр стерильных один раз PBS. Затем заменяем культурную среду каждые 2 дня, до сбора урожая.
На 3-й день после инфекции, лечить клетки с 5 микромоляных тенофовир дисопроксил и 10 микромолейных ламивудин ограничить производство ВГВ репликации промежуточных, которые усиливаются способны обратный ПЦР. На 5-й день, после инфекции, трипсинизировать некоторые клетки с 200 микролитров трипсина ЭДТА и повторно приостановить их в 2 миллилитров D-mem, содержащих 5 микромолярный тенофовир дисопроксил и 10 микромолярной ламивудин. Впоследствии перенесите клеточные суспензии на шесть пластин, чтобы вызвать один раунд митоза.
На 7-й день после инфекции, трипсинизировать расширенные клетки в 400 микролитров трипсина EDTA и приостановить смесь в 1 миллилетер D-mem. Затем перенесите подвеску в 1,5 миллилитровую трубку. Пеллет клеток центрифугации в 500 раз G, в течение пяти минут.
И удалить Су-за-на-дин стремление. Извлекайте ДНК из клеточной гранулы с помощью набора для извлечения ДНК, в соответствии с инструкцией производителя. Для инверсии ДНК выделите от 1,5 до 2,5 микрограммов общего экстракта ДНК в 200 микролитров ПЦР-трубку.
Далее добавьте соответствующее количество ограничения фермента мастер смеси, чтобы привести к 40 микролитер реакции объема, содержащий 1 раз реактора реакции буфера и 10 единиц NCO-1HF. Инкубировать реакцию фермента ограничения в машине PCR на 37 градусов celsius на один час, для оптимальной эффективности пищеварения. Затем инактивировать фермент ограничения, инкубируя его 80 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
Перенесите всю реакцию фермента ограничения в 1,5 миллилитровую трубку. Впоследствии добавьте 400 микролитров буфера T4 dna ligase и 500 единиц лигозы ДНК T4 и тщательно перемешайте. Большой объем реакции стимулирует внутримолекулярную перевязку переваренных фрагментов ДНК.
Инкубировать реакцию перевязки при комнатной температуре в течение 2 часов, чтобы обеспечить полную перевязку. После 2 часов, Инактивировать T4 ДНК лигазы при 70 градусов по Цельсию в течение 20 минут. Затем добавьте 10 микролитров 10 додедекилового сульфата натрия, чтобы обеспечить полную инактивацию либазы T4.
Добавьте хлорид натрия в окончательную концентрацию 100 миллимоляров, и Декстран к окончательной концентрации 90 микрограмм на миллилитр. Смешайте пульс вихри, и кратко спина вниз реакции смеси. Далее добавьте 900 микролитров 100 этанола и перемешайте с помощью инверсии.
Осадок ДНК при отрицательном 20 градусов по Цельсию в одночасье. И гранулы осажденной ДНК центрифугации в 14000 раз G в течение 15 минут. После этого удалите Су-пер-на-на-дин стремление.
Вымойте гранулы с 500 микролитров 70 этанола. И центрифугирование при 14000 раз G в течение 15 минут. Затем удалите этанол путем аспирации и высушите гранулы ДНК при комнатной температуре в течение 20 минут.
Растворите гранулы в 20 микролитров воды и добавьте 20 микролитров ограничитерной ферментной смеси, чтобы привести к 40 микролитровому объему реакции, содержащем 1 раз буфер реакции пищеварения, 5 единиц BSIHK-1 и 5 единиц SPH-1HF. Гнездо, инкубировать реакцию фермента ограничения в тепловом блоке при температуре 37 градусов по Цельсию, в течение 1 часа. Кратко спина вниз реакции смеси, инкубировать ограничение ферментной реакции в тепловом блоке при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 1 часа.
В этой процедуре удалите потенциальные ампликоны из многоразового кремниевого уплотнения коврика, используя раствор деградации ДНК. Промыть коврик тщательно с ДНК свободной воды и воздух высушить его при комнатной температуре. Далее, подготовить один миллилетер 1 раз PCR смесь, содержащая внешний вперед и обратной грунтовки в концентрации 0,5 микромоляра.
Добавить 170 микролитров, если 1 раз PCR смесь скважин A-1 и E-1, в 96 хорошо ПЦР пластины. Затем добавьте 120 микролитров смеси ПЦР в скважины B-1 и H-1. После этого добавьте 10 микролитров перевернутой ДНК в скважины А-1 и Е-1.
Смешайте реакцию в каждой хорошо, мягко pipetting каждый, около 10 раз с помощью P-1000 набор 100 микролитров. Серийно разбавляют образцы из скважин А-1 к Д-1, при соотношении 1:3, передавая по 60 микролитров на каждом шагу. Смешайте скважины на каждом шагу, аккуратно трубя их около 10 раз с помощью P-1000 набор 100 микролитров.
Избегайте формирования пузырьков, повторите процедуру для хорошо E-1, разбавляя до хорошо H-1. Впоследствии выделите 10 микролитров реакционной смеси, используя многоканальные пипетки, из скважин А-1, Н-1, в скважины А-2, Н2, А-3, Н-3 и так далее, пока не доберутся до скважин А-12, Н-12 из 96 скважин. Обложка ПЦР пластины с сухим кремниевым ковриком, и нажмите твердо.
Затем поместите пластину в машину ПЦР и запустите программу, указанную, прежде чем перевести пластину на комнатную температуру. После этого нагрейте булавки репликатора 96 штифта до красного цвета с горелкой Bunsen, затем охладив в течение по крайней мере 5 минут при комнатной температуре. Заполните скважины второй пластины ПЦР с 10 микролитров 1 раз PCR смеси, содержащие гель нагрузки готовы буфер, и внутренний вперед и 1 на 0,5 микромолара.
Аккуратно снимите кремниевый коврик с пластины ПЦР пластины 96 скважин с первого раунда ПЦР и избегайте перекрестного загрязнения между скважинами. Используйте охлажденный репликатор для передачи ПЦР-продуктов пластины 96 хорошо, от первого раунда ПЦР, к недавно выделенным 96 хорошо пластины. Выполнить вложенный ПЦР, используя условие, как указано.
Чтобы изолировать продукты ПЦР, проанализируйте их с помощью гель-электрофорез, используя пластину 96 хорошо, с 1,3 агарозного геля. Для 100 миллилитров геля агарозы, работать на 200 вольт в течение 10 до 15 минут. После этого, акциз ДНК полосы из гелей Агарозы, используя одноразовые соломинки питьевой.
Для каждого продукта ПЦР, место соломы и агарозы гель штепсельная вилка в 1,5 миллилитровую трубку, обрезать солому до размера с ножницами. После этого, извлечь Агароза подключается к каждой трубке, сжимая на конце фрагмента соломы. Затем добавьте 300 микролитров буфера извлечения геля и 5 микролитров стеклянных бусин для извлечения геля в каждую трубку.
Извлекайте продукты ПЦР в соответствии с инструкциями производителя для комплекта для извлечения геля и разбавляют ДНК из бисера 30 микролитров воды. Отправить очищенную ДНК для секвенирования Сэнгер, с вперед грунтовки используется во втором раунде вложенных ПЦР. Здесь показан пример электрофорез агарозного геля успешного обратного ПЦР до и после изоляции продукта ПЦР.
M представляет маркер ДНК последнего, каждый ряд из 12 представляет собой технические репликации при одном разбавлении на пластине ПЦР. В этом случае одиночные продукты ПЦР должны быть достигнуты за счет второго или третьего разбавления каждого образца 1:3. При этих разбавлениях примерно 50% продуктов будут представлять истинные соединения ДНК вирусных клеток.
В то время как другая половина представляет собой усиление промежуточных ДНК HBV. Этот метод позволил исследователям исследовать интеграцию ДНК ВПЧ в высоко контролируемых системах инфекции in vitro. Дополнительные методы, такие как биотематический анализ, могут быть использованы для ответа на дальнейшие вопросы.
Например, если интеграция ДНК ВПЧ происходит в определенных регионах клеточного генома. Не забывайте, что работа с вирусом гепатита В, может быть опасным и соответствующим инфекционного контроля, таких как био-кабинеты безопасности и предварительной вакцинации, всегда должны быть приняты при выполнении этих процедур.
