この方法は、HPV DNAの統合に影響を与える細胞またはウイルス学的要因を見つけるなど、B型肝炎ウイルス学の主要な質問に答えるために使用することができます。この手法には複数の利点があります。比較的安価で実行が簡単で、結果の分析は簡単で、非常に機密性が高く、単一のコピーまでです。
この方法はHBV統合に関する洞察を提供するために使用することができますが、HIV、HTLV-1、HPVなどの宿主細胞ゲノムに統合する他のウイルスにも使用できます。細胞に感染するには、12個のウェルプレートに1ミリリットル当たり200,000個の細胞を、D-memを1ミリリットルで種付けする。翌日、ヘパリンカラムを用いて、HEP-AD 38から精製されたsu-per-na-dinを接種剤として使用し、細胞あたり1,000 VGE、500マイクロリットルの培養培地で細胞に感染させる。
次に、セルを摂氏37度で培養します。次の日に、細胞を1ミリリットルの無菌PBSで2回洗浄する。次いで、収穫まで2日毎に培地を交換する。
3日目のポスト感染時に、5ミクロモルテノホビルジソプロキシルおよび10ミクロモルラミブジンで細胞を治療し、逆PCRによって増幅可能なHBV複製中間体の産生を制限する。5日目、ポスト感染は、トリプシンEDTAの200マイクロリットルで一部の細胞をトリプシン化し、5ミクロモルテノホビルジソプロキシルと10ミクロモルラミブジンを含むD-memの2ミリリットルでそれらを再中断する。続いて、細胞懸濁液を6つのウェルプレートに移し、1ラウンドの有糸分裂を誘発する。
7日目のポスト感染では、400マイクロリットルのトリプシンEDTAで膨張した細胞をトリプシン化し、D-memの1ミリレターで混合物を一時停止する。その後、懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。ペレットは、500回Gで遠心分離により細胞を、5分間用いた。
そして、願望によってSu-per-na-dinを取り除く。メーカーの指示に従って、DNA抽出キットを使用して細胞ペレットからDNAを抽出します。DNA反転の場合は、全DNA抽出物の1.5~2.5マイクログラムを200マイクロリットルPCRチューブに割り当てます。
次に、適切な量の制限酵素マスターミックスを加えて、40マイクロリットルの反応量を生じ、1回の消化反応バッファーと10単位NCO-1HFを含有する。PCRマシンで制限酵素反応を摂氏37度で1時間インキュベートし、最適な消化効率を実現します。次いで、摂氏80度を20分間インキュベートして制限酵素を不活性化する。
制限酵素反応全体を1.5ミリリットルチューブに移します。続いて、400マイクロリットルのT4 DNAリガーゼバッファーと500単位のT4 DNAリガーゼを加え、十分に混合する。大きな反応量は、消化されたDNA断片の分子内結紮を促進する。
完全な結紮を確実にするために、室温で2時間のライゲーション反応をインキュベートする。2時間後、T4DNAリガーゼを摂氏70度で20分間不活性化する。次に、10マイクロリットルのドデデデシル硫酸ナトリウムを加えて、T4リガーゼの完全な不活性化を確実にする。
100ミリモルの最終濃度に塩化ナトリウムを加え、1ミリリットル当たり90マイクログラムの最終濃度にデキストランを加えます。パルス渦によって混合し、反応ミックスを短時間回転させます。次に、900マイクロリットルの100個のエタノールを加え、反転して混ぜます。
一晩で20°Cの負の20度でDNAを沈殿させる。そして14000倍Gで遠心分離により沈殿したDNAを15分間ペレットとした。その後、吸引でスー・パー・ナ・ダインを取り除きます。
ペレットを500マイクロリットルの70個のエタノールで洗います。15分間Gの14000倍で遠心分離を行う。その後、吸引によりエタノールを除去し、室温で20分間空気乾燥した。
ペレットを20マイクロリットルの水に溶解し、20マイクロリットルの制限酵素マスターミックスを加えて、1回の消化反応バッファー、5単位BSIHK-1、および5単位のSPH-1HFを含む40マイクロリットルの反応量を生じる。巣、摂氏37度のヒートブロック内で制限酵素反応を1時間インキュベートする。反応ミックスを短時間スピンダウンし、摂氏65度のヒートブロックで制限酵素反応を1時間インキュベートする。
この手順では、DNA分解溶液を使用して、再利用可能なシリコンマットシールから潜在的なアンプリコンを除去します。マットをDNAフリーの水で十分に洗い流し、室温で空気乾燥させます。次に、0.5マイクロモルの濃度で外側前方および逆プライマーを含有するPCRミックスを1回1ミリレターで調製する。
1回PCRを1回混合した場合は170マイクロリットルをウェルA-1とE-1に、96ウェルPCRプレートに加えます。次に、1回のPCRミックスの120マイクロリットルをウェルB-1とH-1に加えます。その後、10マイクロリットルの逆DNAをウェルA-1およびE-1に加える。
各ウェルに反応を混ぜ、各ウェルを軽くピペット化し、P-1000を100マイクロリットルにセットして約10回使用する。各ステップで60マイクロリットルを移すことによって、ウェルA-1からD-1までのサンプルを1:3の比率で連続して希釈します。P-1000を100マイクロリットルに設定して約10回軽くピペット処理して、各ステップで井戸を混ぜます。
泡を形成することを避け、よくE-1の手順を繰り返し、よくH-1に希釈する。続いて、反応混合物の10マイクロリットルを割り当て、マルチチャネルピペットを使用して、ウェルズA-1、H-1から、ウェルA-2、H2、A-3、H-3および同様に、96ウェルプレートのウェルA-12、H-12に達するまでウェルA-2、H-3、および同様に。PCR プレートをドライシリコンマットで覆い、しっかりと押します。
次に、プレートをPCR機に入れ、示されたプログラムを実行してから、プレートを室温に移します。その後、96ピンレプリケータのピンをブンゼンバーナーで赤熱し、室温で少なくとも5分間冷やします。2番目のPCRプレートのウェルを10マイクロリットルのPCRミックスで満たし、ゲル負荷対応バッファを含み、内側の前方および逆を0.5マイクロモルで充填します。
第1ラウンドPCRから96ウェルプレートのPCRプレートからシリコンマットを慎重に取り除き、ウェル間の交差汚染を避けてください。冷却されたレプリケータを使用して、最初のラウンドPCRから新たに割り当てられた96ウェルプレートに96ウェルプレートのPCR産物を移します。示された条件を使用して、ネストされたPCRを実行します。
PCR産物を分離するには、1.3アガロースゲルを用いて96ウェルプレートを使用して、ゲル電気泳動で分析します。100ミリリットルのアガロースゲルの場合、200ボルトで10〜15分間実行します。その後、使い捨ての飲みストローを使用して、アガロースゲルからDNAバンドを切除します。
PCR製品ごとに、ストローとアガロースゲルプラグを1.5ミリリットルチューブに入れ、ストローをハサミでサイズにトリミングします。その後、ストロー断片の端部を絞って、アガロースプラグを各チューブに排出します。次に、300マイクロリットルのゲル抽出バッファーを加え、各チューブに5マイクロリットルのゲル抽出ガラスビーズを加えます。
ゲル抽出キットのメーカーの指示に従って PCR 製品を抽出し、ビーズから 30 マイクロリットルの水で DNA を希釈します。第2ラウンドのネストPCRで使用されるフォワードプライマーを使用して、サンガーシーケンシング用に精製されたDNAを提出します。PCR産物の分離前後に成功した逆PCRのアガロースゲル電気泳動の例を示します。
Mは後者のDNAマーカーを表し、12の各行は、PCRプレート上の単一希釈時の技術的複製を表す。この場合、単一PCR産物は、各サンプルの2番目または3番目の1:3希釈によって達成されるべきである。これらの希釈では、製品の約50%が真のウイルス細胞DNA接合を表します。
一方、残りの半分はHBV DNA中間体の増幅を表す。この技術により、研究者は高度に制御されたインビトロ感染システムにおけるHPV DNAの統合を探求することができました。バイオテマティクス分析などの追加の方法を使用して、さらなる質問に答えることができます。
例えば、HPV DNAの統合が細胞ゲノムの特定の領域で起こる場合がある。感染B型肝炎ウイルスを扱うことは、危険で適切な感染制御であり得る、バイオ安全キャビネットおよび事前ワクチン接種は、これらの手順を実行している間、常に取られるべきであることを忘れないでください。
