Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nella virologia dell'epatite B, come trovare fattori cellulari o virologici che influenzano l'integrazione del DNA HPV. Ci sono molteplici vantaggi in questa tecnica. È relativamente economico, e facile da eseguire, l'analisi dei risultati è semplice, ed è molto sensibile, fino a singole copie.
Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per fornire informazioni sull'integrazione hbv, può anche essere utilizzato per altri virus che si integrano nel genoma della cellula ospite, come HIV, HTLV-1 o HPV. Per infettare le cellule, seminare 200.000 cellule per millilitro in una piastra di dodici pozzetto, con 1 millilitro di D-mem. Il giorno successivo, utilizzare la colonna di eparina purificata su-per-na-din da HEP-AD 38 come inoculante per infettare le cellule a 1.000 VGE per cella, in 500 microlitri di mezzo di coltura.
Quindi, coltura le cellule a 37 gradi Celsius. Quindi, il giorno successivo, lavare le cellule due volte con un millilitro di sterile una volta PBS. Quindi, sostituire il mezzo di coltura ogni 2 giorni, fino alla raccolta.
Al giorno 3 dopo l'infezione, trattare le cellule con 5 micromolare tenofovir disoproxil e 10 micromolare Lamivudine per limitare la produzione di intermedi replicativi HBV amplificati dalla PCR inversa. Al giorno 5, dopo l'infezione, tripinare alcune cellule con 200 microlitri di Tripsiderina EDTA e sospenderle in 2 millilitri di D-mem contenenti 5 micromolare Tenofovir disoproxil e 10 micromolare Lamivudine. Successivamente, trasferire le sospensioni cellulari su una piastra a sei pozza, per indurre un ciclo di mitosi.
Al giorno 7 dopo l'infezione, tripinare le cellule espanse in 400 microlitri di Trypsin EDTA e sospendere la miscela in 1 millilitro di D-mem. Quindi, trasferire la sospensione in un tubo da 1,5 millilitri. Pellet le cellule per centrifugazione a 500 volte G, per cinque minuti.
E rimuovere il Su-per-na-din per aspirazione. Estrarre il DNA dal pellet cellulare utilizzando un kit di estrazione del DNA, secondo le istruzioni del produttore. Per l'inversione del DNA, allocare da 1,5 a 2,5 microgrammi dell'estratto totale di DNA in un tubo PCR da 200 microliter.
Successivamente, aggiungere la quantità appropriata di miscela principale enzimatica di restrizione per ottenere un volume di reazione di 40 microliter, contenente 1 volte il buffer di reazione di digestione e 10 unità NCO-1HF. Incubare la reazione enzimatica di restrizione in una macchina PCR a 37 gradi Celsius per un'ora, per un'efficienza di digestione ottimale. Quindi, inattivare l'enzima di restrizione incubandolo di 80 gradi Celsius per 20 minuti.
Trasferire l'intera reazione enzimatica di restrizione in un tubo da 1,5 millilitri. Successivamente, aggiungere 400 microlitri di tampone di ligasi del DNA 1 volte T4 e 500 unità di ligasi del DNA T4 e mescolare accuratamente. Un grande volume di reazione incoraggia la legatura intramolecolare dei frammenti di DNA digeriti.
Incubare la reazione di legatura a temperatura ambiente per 2 ore per garantire la legatura completa. Dopo 2 ore, inattivare la ligasi del DNA T4 a 70 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi, aggiungere 10 microlitri di 10 solfato di dodecil di sodio per garantire la completa inattivazione della ligasi T4.
Aggiungere cloruro di sodio a una concentrazione finale di 100 millimolare e Dextran a una concentrazione finale di 90 microgrammi per millilitro. Mescolare con il vortice di impulsi e ruotare brevemente verso il basso il mix di reazione. Quindi, aggiungere 900 microlitri di 100 etanolo e mescolare per inversione.
Precipitare il DNA a -20 gradi Celsius durante la notte. E pellettò il DNA precipitato per centrifugazione a 14000 volte G per 15 minuti. Successivamente, rimuovere il Su-per-na-dine per aspirazione.
Lavare il pellet con 500 microlitri da 70 etanolo. E centrifugazione a 14000 volte G per 15 minuti. Quindi, rimuovere l'etanolo per aspirazione e asciugare all'aria il pellet di DNA a temperatura ambiente per 20 minuti.
Sciogliere il pellet in 20 microlitri di acqua e aggiungere 20 microlitri di miscela di master enzimatico limitante per ottenere un volume di reazione di 40 microlitri, contenente 1 volte il buffer di reazione di digestione, 5 unità BSIHK-1 e 5 unità di SPH-1HF. Nidificare, incubare la reazione enzimatica di restrizione in un blocco di calore a 37 gradi Celsius, per 1 ora. Spingi brevemente verso il basso la miscela di reazione, incuba la reazione enzimatica di restrizione in un blocco di calore a 65 gradi Celsius per 1 ora.
In questa procedura, rimuovere potenziali ampliconi da una guarnizione del tappetino di silicio riutilizzabile, utilizzando una soluzione di degradazione del DNA. Risciacquare accuratamente il tappetino con acqua priva di DNA e asciugarlo all'aria a temperatura ambiente. Successivamente, preparare un millilitro di 1 miscela PCR contenente i primer esterni avanti e indietro ad una concentrazione di 0,5 micromolare.
Aggiungere 170 microlitri se il 1 per PCR si mescola ai pozzi A-1 ed E-1, in una piastra PCR da 96 porri. Quindi, aggiungere 120 microlitri del mix 1 volte PCR ai pozzi B-1 e H-1. Successivamente, aggiungere 10 microlitri del DNA invertito ai pozzi A-1 ed E-1.
Mescolare la reazione in ogni pozzo, tubazionando delicatamente ciascuno, circa 10 volte utilizzando un P-1000 impostato su 100 microlitri. Diluire serialmente i campioni dai pozzi A-1 a D-1, con un rapporto di 1:3 trasferendo 60 microlitri ad ogni passo. Mescolare i pozzi ad ogni passo tubazionandoli delicatamente circa 10 volte utilizzando un P-1000 impostato su 100 microlitri.
Evitare di formare bolle, ripetere la procedura per il pozzo E-1, diluendo fino al pozzo H-1. Successivamente, allocare 10 microlitri della miscela di reazione, utilizzando pipetta multicanale, da Wells A-1, H-1, in pozzi A-2, H2, A-3, H-3 e così via, fino a raggiungere i pozzi A-12, H-12 della piastra del pozzo 96. Coprire la piastra PCR con un tappetino di silicio asciutto e premere con fermezza.
Quindi, posizionare la piastra in una macchina PCR ed eseguire il programma indicato, prima di trasferire la piastra a temperatura ambiente. Successivamente, riscaldare i perni di un replicatore a 96 pin a ro-caldo con un bruciatore Bunsen, quindi raffreddare per almeno 5 minuti a temperatura ambiente. Riempire i pozzali di una seconda piastra PCR con 10 microlitri da 1 volta la miscela PCR, contenente un tampone pronto per il carico di gel, e l'interno in avanti e indietro a 0,5 micromolare.
Rimuovere con cura il tappetino di silicio dalla piastra PCR della piastra del pozzo 96 dalla PRIMA PCR rotonda ed evitare la contaminazione incrociata tra i pozzi. Utilizzare il replicatore raffreddato per trasferire i prodotti PCR della piastra del pozzo 96, dalla PCR del primo round, alla piastra del pozzo da 96 appena assegnata. Effettuare la PCR nidificata, utilizzando la condizione come indicato.
Per isolare i prodotti PCR, analizzarli per elettroforesi gel, utilizzando una piastra da 96 porri, con gel di agarosio 1.3. Per un gel Agarose da 100 millilitri, correre a 200 volt per 10-15 minuti. Successivamente, asportare le bande di DNA dai gel di Agarosio, usando cannucce da bere usa e getta.
Per ogni prodotto PCR, posizionare la spina di paglia e gel Agarose in un tubo da 1,5 millilitri, tagliare la paglia a misura con le forbici. Successivamente, espellere le spine di Agarosio in ogni tubo, spremendo all'estremità del frammento di paglia. Quindi aggiungere 300 microlitri di tampone di estrazione del gel e 5 microlitri di perline di vetro per l'estrazione del gel a ciascun tubo.
Estrarre i prodotti PCR per le istruzioni del produttore per il kit di estrazione del gel e diluire il DNA dalle perline con 30 microlitri di acqua. Invia il DNA purificato per il sequenziamento sanger, con il primer in avanti utilizzato nella PCR nidificata al secondo round. Un esempio di elettroforesi in gel di Agarosio di PCR inversa di successo, prima e dopo l'isolamento del prodotto PCR, è mostrato qui.
M rappresenta il marcatore DNA quest'ultimo, ogni riga di 12 rappresenta le repliche tecniche ad una singola diluizione sulla piastra PCR. In questo caso, i singoli prodotti PCR dovrebbero essere ottenuti con la seconda o la terza diluizione 1:3 di ciascun campione. A queste diluizioni, circa il 50% dei prodotti rappresenterà vere e propria giunzione del DNA delle cellule virali.
Mentre l'altra metà rappresenta l'amplificazione degli intermedi del DNA HBV. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori di esplorare l'integrazione del DNA HPV in sistemi di infezione in vitro altamente controllati. Ulteriori metodi, come l'analisi biotematica, possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande.
Ad esempio, se l'integrazione del DNA HPV avviene in regioni specifiche del genoma cellulare. Non dimenticare che lavorare con il virus dell'epatite B, può essere pericoloso e controlli di infezione appropriati, come armadietti di sicurezza bio e vaccinazione preventiva, dovrebbe sempre essere preso durante l'esecuzione di questa procedura.
