Diese Methode kann verwendet werden, um wichtige Fragen in der Hepatitis-B-Virologie zu beantworten, wie z. B. das Finden zellulärer oder virologischer Faktoren, die die HPV-DNA-Integration beeinflussen. Diese Technik hat mehrere Vorteile. Es ist relativ billig und einfach durchzuführen, Die Analyse der Ergebnisse ist einfach, und es ist sehr empfindlich, bis auf einzelne Kopien.
Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in die HBV-Integration zu geben, kann sie auch für andere Viren verwendet werden, die sich in das Genom der Wirtszellen integrieren, wie HIV, HTLV-1 oder HPV. Um die Zellen zu infizieren, Samen 200 000 Zellen pro Milliliter in einer zwölf Brunnenplatte, mit 1 Milliliter D-Mem. Verwenden Sie am nächsten Tag die Heparin-Säule, die su-per-na-din von HEP-AD 38 als Inokulant gereinigt wird, um die Zellen bei 1 000 VGE pro Zelle in 500 Mikroliter Kulturmedium zu infizieren.
Dann kulturieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Dann, am nächsten Tag, waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter steril ein mal PBS. Dann ersetzen Sie das Kulturmedium alle 2 Tage, bis zur Ernte.
Behandeln Sie an Tag 3 nach der Infektion die Zellen mit 5 mikromolaren Tenofovirdisvidensoproxil und 10 Mikromolar Lamivudin, um die Produktion von HBV-replikativen Zwischenprodukten zu begrenzen, die durch inverse PCR amplizierend sind. An Tag 5, nach der Infektion, trypsinisieren einige Zellen mit 200 Mikroliter Trypsin EDTA und setzen sie in 2 Milliliter D-Mem enthält 5 Mikromolar Tenofovirdisdisoproxil und 10 Mikromolar Lamivudin. Anschließend übertragen Sie die Zellsuspensionen auf eine sechs Wellplatte, um eine Runde Mitose zu induzieren.
An Tag 7 nach der Infektion, Trypsinize die erweiterten Zellen in 400 Mikroliter Trypsin EDTA und suspendieren die Mischung in 1 Millileter von D-Mem. Dann übertragen Sie die Suspension in ein 1,5 Milliliter Rohr. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 500 mal G, für fünf Minuten.
Und entfernen Sie die Su-per-na-din durch Aspiration. Extrahieren Sie die DNA aus dem Zellpellet mit einem DNA-Extraktionskit, wie der Hersteller anweisungsgemäß. Bei DNA-Inversion 1,5 bis 2,5 Mikrogramm des gesamten DNA-Extrakts in eine 200-Mikroliter-PCR-Röhre zuordnen.
Als nächstes fügen Sie die entsprechende Menge an Restriktionsenzym-Master-Mix hinzu, um ein Reaktionsvolumen von 40 Mikrolitern zu erzielen, das 1-fache Verdauungsreaktionspuffer und 10 Einheiten NCO-1HF enthält. Inkubieren Sie die Restriktionsenzymreaktion in einer PCR-Maschine bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, für eine optimale Verdauungseffizienz. Dann inaktivieren Sie das Restriktionsenzym, indem Sie es 20 Minuten lang 80 Grad Celsius inkubieren.
Übertragen Sie die gesamte Restriktionsenzymreaktion auf eine 1,5-Milliliter-Röhre. Anschließend 400 Mikroliter des 1-fachen T4-DNA-Ligasepuffers und 500 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzufügen und gründlich mischen. Großes Reaktionsvolumen fördert die intramolekulare Ligation der verdauten DNA-Fragmente.
Inkubieren Sie die Ligationsreaktion bei Raumtemperatur für 2 Stunden, um eine vollständige Ligation zu gewährleisten. Nach 2 Stunden, Inaktivieren Sie die T4 DNA Ligase bei 70 Grad Celsius für 20 Minuten. Fügen Sie dann 10 Mikroliter 10 Natriumdodedecylsulfat hinzu, um eine vollständige Inaktivierung der T4-Ligase zu gewährleisten.
Natriumchlorid zu einer Endkonzentration von 100 Millimolaren und Dextran zu einer Endkonzentration von 90 Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen. Mischen Sie durch Pulswirbelung, und drehen Sie den Reaktionsmix kurz nach unten. Als nächstes 900 Mikroliter 100 Ethanol hinzufügen und durch Inversion mischen.
Niederschlagen Sie die DNA bei negativen 20 Grad Celsius über Nacht. Und pellet die gefällte DNA durch Zentrifugation bei 14000 mal G für 15 Minuten. Entfernen Sie anschließend die Su-per-na-dine durch Aspiration.
Waschen Sie das Pellet mit 500 Mikrolitern 70 Ethanol. Und Zentrifugation bei 14000 mal G für 15 Minuten. Dann entfernen Sie das Ethanol durch Aspiration und trocknen Sie das DNA-Pellet bei Raumtemperatur für 20 Minuten.
Lösen Sie das Pellet in 20 Mikroliter Wasser und fügen Sie 20 Mikroliter Restrict-Enzym-Master-Mix hinzu, um ein Reaktionsvolumen von 40 Mikrolitern zu ergeben, das 1-fache Verdauungsreaktionspuffer, 5 Einheiten BSIHK-1 und 5 Einheiten SPH-1HF enthält. Nest, inkubieren Sie die Restriktionsenzymreaktion in einem Wärmeblock bei 37 Grad Celsius, für 1 Stunde. Drehen Sie den Reaktionsmix kurz herunter, inkubieren Sie die Restriktionsenzymreaktion in einem Wärmeblock bei 65 Grad Celsius für 1 Stunde.
Entfernen Sie bei diesem Verfahren potenzielle Amplicons aus einer wiederverwendbaren Silikonmattendichtung, indem Sie eine DNA-Abbaulösung verwenden. Spülen Sie die Matte gründlich mit DNA-freiem Wasser und trocknen Sie sie bei Raumtemperatur an der Luft. Als nächstes bereiten Sie einen Millileter von 1 mal PCR-Mix mit der äußeren Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung mit einer Konzentration von 0,5 Mikromolar vor.
Fügen Sie 170 Mikroliter hinzu, wenn die 1-fache PCR-Mischung zu den Brunnen A-1 und E-1, in einer 96 Well PCR Platte. Fügen Sie dann 120 Mikroliter der 1-fachen PCR-Mischung zu den Brunnen B-1 und H-1 hinzu. Fügen Sie danach 10 Mikroliter der invertierten DNA zu den Brunnen A-1 und E-1 hinzu.
Mischen Sie die Reaktion in jedem Brunnen, indem Sie jeden sanft pipetieren, etwa 10 Mal mit einem P-1000 auf 100 Mikroliter eingestellt. Die Proben von den Brunnen A-1 bis D-1 im Verhältnis 1:3 durch Übertragung von 60 Mikrolitern bei jedem Schritt seriell verdünnen. Mischen Sie die Brunnen bei jedem Schritt, indem Sie sie mit einem P-1000, der auf 100 Mikroliter eingestellt ist, etwa 10 Mal sanft pipetieren.
Vermeiden Sie blasen, wiederholen Sie das Verfahren für Gut E-1, Verdünnung bis gut H-1. Anschließend 10 Mikroliter des Reaktionsgemisches mit Mehrkanalpipette aus Den Brunnen A-1, H-1 in die Brunnen A-2, H2, A-3, H-3 und so-on zuordnen, bis die Brunnen A-12, H-12 der 96-Wellplatte erreicht werden. Bedecken Sie die PCR-Platte mit einer trockenen Siliziummatte und drücken Sie fest.
Legen Sie dann die Platte in eine PCR-Maschine und führen Sie das angegebene Programm aus, bevor Sie die Platte auf Raumtemperatur übertragen. Danach die Stifte eines 96-Pin-Replikators mit einem Bunsen-Brenner auf Rot-Heiß erhitzen und dann mindestens 5 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Füllen Sie die Bohrungen einer zweiten PCR-Platte mit 10 Mikrolitern 1-facher PCR-Mischung, die einen Gel-Last-Ready-Puffer enthält, und den inneren Vorwärts- und Rückwärtsgang bei 0,5 Mikromolar.
Entfernen Sie vorsichtig die Siliziummatte von der PCR-Platte der 96-Well-Platte aus der ersten Runde pcR und vermeiden Sie Kreuzkontaminationen zwischen Brunnen. Verwenden Sie den gekühlten Replikator, um die PCR-Produkte der 96-Well-Platte von der ersten Runde PCR auf die neu zugeordnete 96-Well-Platte zu übertragen. Führen Sie die verschachtelte PCR mit der angegebenen Bedingung aus.
Um die PCR-Produkte zu isolieren, analysieren Sie sie durch Gelelektrophorese, mit einer 96-Well-Platte, mit 1,3 Agarose-Gel. Für ein 100 Milliliter Agarose Gel, laufen bei 200 Volt für 10 bis 15 Minuten. Anschließend werden die DNA-Bänder aus den Agarose-Gelen mit Einweg-Trinkhalmen verwendet.
Legen Sie für jedes PCR-Produkt den Strohhalm und den Agarose-Gelstecker in ein 1,5-Milliliter-Rohr, schneiden Sie das Stroh mit einer Schere auf Größe. Anschließend werfen Sie die Agarose-Stecker in jedes Rohr, indem Sie sich am Ende des Strohfragments quetschen. Dann fügen Sie 300 Mikroliter Gel ExtraktionPuffer, und 5 Mikroliter Gel Extraktion Glasperlen zu jedem Rohr.
Extrahieren Sie die PCR-Produkte gemäß herstellerspezifischen Anweisungen für das Gel-Extraktionskit, und verdünnen Sie die DNA aus den Perlen mit 30 Mikroliter Wasser. Reichen Sie die gereinigte DNA für die Sanger-Sequenzierung ein, wobei die Vorwärtsgrundierung in der zweiten Runde der verschachtelten PCR verwendet wird. Ein Beispiel für die Agarose-Gelelektrophorese erfolgreicher inverser PCR vor und nach der PCR-Produktisolierung ist hier zu sehen.
M stellt den DNA-Marker letzteres dar, jede 12er-Zeile stellt die technischen Replikationen bei einer einzigen Verdünnung auf der PCR-Platte dar. In diesem Fall sollten einzelne PCR-Produkte durch die zweite oder dritte Verdünnung jeder Probe 1:3 verwässert werden. Bei diesen Verdünnungen stellen etwa 50 % der Produkte echte Dna-Verbindungen von Viruszellen dar.
Während die andere Hälfte eine Verstärkung von HBV-DNA-Zwischenprodukten darstellt. Diese Technik hat es Forschern ermöglicht, die HPV-DNA-Integration in hochgradig kontrollierte In-vitro-Infektionssysteme zu erforschen. Zur Beantwortung weiterer Fragen können zusätzliche Methoden wie die Biothematik-Analyse eingesetzt werden.
Zum Beispiel, wenn die HPV-DNA-Integration in bestimmten Regionen des zellulären Genoms stattfindet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Infektion Hepatitis B Virus, kann gefährlich sein und geeignete Infektionskontrollen, wie Bio-Sicherheitsschränke und vorherige Impfung, sollte immer während der Durchführung dieses Verfahrens genommen werden.
