Разработка мышиных моделей болезни Менетрие

Настоящее исследование демонстрирует, что у мышей MT-TGFα наблюдается спазмолитическая полипептид-экспрессирующая метаплазия (SPEM) в желудке. Утечка промотора не позволила продемонстрировать, что основные клеточные линии восходят к SPEM. Таким образом, мы дополнительно разработали модель мыши, индуцируемую доксициклином (Doxi-TGFα) и подтвердили, что SPEM происходит из главных клеток.

Болезнь Менетье (БМ) — это редкое приобретенное предраковое заболевание желудка, характеризующееся гигантскими складчатыми складками, сниженной секрецией кислоты и потерей белка. У пациентов с МД наблюдается повышенная экспрессия лиганда рецептора EGF (EGFR), трансформирующего фактор роста-α (TGFα) в желудке. Нейтрализующее EGFR антитело, цетуксимаб, приводит к быстрому клиническому улучшению и гистологической ремиссии. Помимо этих результатов, этиология и лежащие в их основе молекулярные механизмы не совсем понятны. Трансгенная линия мышей Metallothionein (MT)-TGFα является первой моделью мыши с МД, которая повторяет гистопатологические особенности МД, включая фовеолярную гиперплазию и потерю париетальных клеток. В этой модели мыши TGFα управляется индуцируемым тяжелыми металлами усилителем/промотором МТ. В предыдущих исследованиях сульфат цинка (ZnSO4) использовался в питьевой воде или внутрибрюшинных инъекциях сульфата кадмия (CdSO4) для индуцирования TGFα. Тем не менее, мы обнаружили, что у мышей MT-TGFα фенотипы развиваются без обработки тяжелыми металлами, что указывает на негерметичность промотора. Мы также обнаружили, что сверхэкспрессия TGFα подавляет экспрессию Mist1, фактора транскрипции, важного для дифференцировки главных клеток, тем самым препятствуя генетическим манипуляциям в главных клетках с использованием мышиной линии Mist1-CreERT2. Чтобы преодолеть это, мы разработали индуцируемую мышиную модель (Doxi-TGFα), в которой TGFα индуцируется лечением доксициклином (CMV-rtTA; TetO-TGFα). Несмотря на то, что мышиная модель Doxi-TGFα развивает более мягкие фенотипы, чем модель MT-TGFα, она повторяет особенности МД, включая фовеолярную гиперплазию и потерю париетальных клеток. Используя мышиную модель Doxi-TGFα, мы обнаружили, что спазмолитическая метаплазия, экспрессирующая полипептиды (SPEM), индуцируется при МД, а SPEM получается из главных клеток путем трассировки линии линии Mist1-CreERT2. Обе модели мышей MT-TGFα и Doxi-TGFα предлагают модели МД in vivo и полезны для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза МД, и вариантов лечения заболевания. Мыши Doxi-TGFα также будут полезной моделью для изучения эффектов сверхэкспрессии TGFα в других тканях.

Болезнь Менетье (БМ), также известная как гипертрофическая гастропатия с потерей белка, является редким предраковым заболеванием желудка. В желудках пациентов с МД наблюдается массивная фовеолярная гиперплазия, которая приводит к увеличению секреции желудочной слизи, и уменьшению количества париетальных клеток, что приводит к снижению секреции желудочной кислоты. Кроме того, белок избирательно теряется по всей слизистой оболочке желудка, что приводит к гипоальбуминемии и периферическим отекам ^1,2,3. Патогенез МД не был известен до тех пор, пока не было сообщено, что трансгенные мыши с гиперэкспрессией TGFα под контролем энхансера/промотора гена металлотионеина (МТ) повторяли фенотипы МД в желудке ^4,5. В желудках пациентов с МД также наблюдалась повышенная экспрессия TGFα, лиганда рецептора EGF (EGFR). Цетуксимаб, антитело против EGFR, было признано первым эффективным лекарственным средством для лечения МД, что подтвердило, что активация EGFR при сверхэкспрессии TGFα способствует патогенезу МД ^6,7.

С тех пор линейка мышей MT-TGFα используется в качестве модели мыши для MD. Поскольку экспрессия TGFα регулируется геном реакции на тяжелые металлы, усилитель/промотор металлотионеина, сульфат цинка (ZnSO4) в питьевой воде или внутрибрюшинные инъекции сульфата кадмия (CdSO4) используются для индуцирования экспрессии TGFα ^5,8. Мышиная модель MT-TGFα была дополнительно охарактеризована для фенотипов МД. Используя эту мышиную модель, было показано, что TGFα индуцирует дифференцировку поверхностных фовеолярных клеток, секретирующих муцин, в то же время ингибируя дифференцировку в кислот-секретирующие париетальные клетки и главные клеточные линии, секретирующие пепсиноген ^9,10. Также было показано, что слизистая оболочка тела желудка/фундального аппарата антрализуется и что в основании желудочных желез присутствуют факторы трилистника 2 (TFF2)-положительные, что свидетельствует о наличии спазмолитической полипептид-экспрессирующей метаплазии (SPEM) при МД ^8,11.

В данном исследовании мы показываем, как у мышей MT-TGFα развиваются признаки МД без обработки тяжелыми металлами. Эти фенотипы включают потерю экспрессии Mist1, транскрипционного фактора, который необходим для дифференцировки главных клеток и теряется при SPEM. Из-за потери Mist1 мышиная линия Mist1-CreERT2¹² не могла быть использована вместе с мышиной линией MT-TGFα для изучения того, возникает ли SPEM в MD из главных клеток путем трассировки линии. С целью преодоления негерметичности модели мыши MT-TGFα мы разработали новую модель мыши MD (CMV-rtTA¹³; TetO-TGFα¹⁴), где TGFα индуцируется лечением доксициклином (Doxi-TGFα). Мы убедились, что эта модель мыши также обладает функциями MD. Используя мышиную модель Doxi-TGFα, мы показываем, что SPEM возникает из главных клеток путем трассировки линии линии Mist1-CreERT2. В текущем исследовании мы представляем две модели мышей MD. Обе модели могут быть использованы для исследования патогенеза и поиска потенциальных терапевтических мишеней. Новая мышь Doxi-TGFα будет особенно ценна в тех случаях, когда необходимо точно контролировать инициацию фенотипов МД или когда требуется генетическая модификация в главных клетках с использованием линии мышей Mist1-CreERT2.

Все процедуры и процедуры животноводства были одобрены Институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию в Йельском университете и в соответствии с Принципами правительства США по использованию и уходу за животными, используемыми в исследованиях, обучении и тестировании.

1. Эксперименты на мышах

1. Лечение у мышей
   1. Мышей MT-TGFα (как самцов, так и самок в возрасте 2-4 месяцев) вводили 25 мМ ZnSO4 в питьевой воде в течение 2 недель, чтобы вызвать гиперэкспрессию TGFα.
   2. Лечить CMV-rtTA/+; Мышам TetO-TGFα/+ (Doxi-TGFα) (как самцам, так и самкам в возрасте 2-4 месяцев) вводили 2 мг/мл доксициклина в питьевой воде в течение 2 недель для индуцирования гиперэкспрессии TGFα.
   3. Добавьте один туман1-CreERT2/+; R26-LSL-mTmG/+ самец или самка мыши и добавьте одну мышь Doxi-TGFα противоположного пола в клетку для отслеживания линии главных клеток в моделях мышей MD.
   4. Впрыскиваем туман1-CreERT2/+; R26-LSL-mTmG/+; CMV-rtTA/+; Мышам TetO-TGFα/+ (как самцам, так и самкам в возрасте 2-4 месяцев) тамоксифен (37,5 мг/кг) внутрибрюшинно. Делайте инъекции в течение 7 дней подряд, чередуя правый и левый нижний квадранты брюшной полости и избегая попадания во внутренние органы. Индуцировать экспрессию TGFα путем обработки доксициклином (2 мг/мл) в питьевой воде в течение 2 недель.
      Примечание: Проверьте отсутствие тамоксифен-индуцированного повреждения желудка^15,16, как это делается здесь путем подсчета теменных клеток у мышей дикого типа с лечением тамоксифеном и без него (дополнительный рисунок 1).
2. Фиксация тканей желудка
   1. Усыпляйте мышей при передозировке изофлурана после 2 недель гиперэкспрессии TGFα. С помощью банки с эксикатором в вытяжном шкафу для химикатов поместите мышей на перфорированную платформу, которая предотвращает прямой контакт с жидким анестетиком. Закройте крышку и наблюдайте за мышами до тех пор, пока они не начнут дышать более 60 с, после чего произойдет вывих шейки матки.
   2. Рассеките желудок, разрезав в гастроэзофагеальном соединении, разрезав двенадцатиперстную кишку диаметром 5 мм, прикрепленную к животу, и удалив все брюшные связки вокруг желудка с помощью ножниц и щипцов (рисунок 1A).
   3. Закапывайте фосфатно-солевой буфер (PBS) с помощью шприца объемом 10 мл с наконечником пипетки, прикрепленным к двенадцатиперстной кишке. Сожмите его пальцами, чтобы удалить содержимое люминала. Повторите 3 раза (рисунок 1B).
   4. Надуйте желудок 2 мл 10% формалина с помощью другого шприца объемом 10 мл с прикрепленным наконечником для пипетки. Плотно зажмите щипцами в гастродуоденальном соединении на 5-10 с, одновременно удаляя кончик из желудка (рисунок 1С).
   5. Погрузите надутый живот в 10% формалин на ночь при температуре 4 °C с встряхиванием (рисунок 1D).
      ВНИМАНИЕ: При работе с токсичными веществами, такими как формалин, используйте надлежащие средства защиты.
3. Подготовка желудка к заделке парафина
   1. Вырежьте двенадцатиперстную кишку и предбрюшную кишку с помощью бритвенного лезвия (рисунок 1E). Промойте ткани желудка PBS в течение 5 минут, 3 раза с встряхиванием.
   2. Разрежьте живот на 3-4 кольца одинаковой толщины (3-5 мм) с помощью лезвия бритвы. Заделайте животные кольца в 2% агарозу для поддержания ориентации. Расположите кольца живота последовательно от проксимального к дистальному, расположив сторону меньшей кривизны в том же направлении (рисунок 1F).
   3. Поместите желудочные кольца, залитые агарозой, в тканевую кассету (рисунок 1G) и отправьте образцы в гистологическое отделение для заделки парафина¹⁷.

2. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Подготовка предметного стекла
   1. Нагрейте предметные стекла с парафиновыми срезами на них в сухой духовке или на термоблоке, установленном на 60 °C, минимум от 1 часа до ночи. Дайте остыть до комнатной температуры и поместите в решетку для слайдов.
2. Депарафинизация, регидратация и извлечение антигена
   1. Наклейте этикетки на две банки с предметными стеклами, A и B, и наполните каждую достаточным количеством раствора Trilogy для полного погружения ткани.
   2. Поместите решетку для слайдов в банку А и поставьте обе банки в скороварку. Установите скороварку на высокое давление на 15 минут. Дайте скороварке остыть, прежде чем открывать и доставать слайды.
   3. Немедленно поместите решетку для слайдов из банки А в банку Б на 2 минуты, чтобы убедиться, что парафин удален со слайдов. Извлеките предметные стекла из банки B и поместите их в деионизированную (DI) воду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Баночка А может быть заполнена использованной трилогией. Новую трилогию всегда следует использовать в банке Б.
   4. Поместите предметные стекла в трис-буферный физиологический раствор (TBS) на 5 минут, прежде чем приступить к блокировке.
3. Блокировка неспецифических фоновых окрашиваний
   1. Снимите слайды со стойки для слайдов и постучите ими по сторонам, чтобы удалить излишки TBS.
   2. Нарисуйте рамку вокруг ткани с помощью гидрофобного маркера. Нанесите блокирующий буфер, чтобы полностью покрыть ткань, и инкубируйте в течение 30-60 минут во влажной камере при комнатной температуре.
4. Инкубация с первичными антителами
   1. Отбирают первичные антитела к белкам-мишеням, выращенным у разных видов хозяев, и разводят в разбавителе антител в соответствии с рекомендацией производителя. Для данного исследования использовали следующие антитела: H⁺/K⁺-АТФаза, GIF, Mist1^18,19 и CD44v9^20,21. Подробную информацию о первичных антителах можно найти в Таблице материалов.
   2. Удалите блокирующий буфер, нанесите разведенные антитела и поместите предметные стекла обратно в увлажненную камеру. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C.
   3. Удалите первичные антитела и промойте предметные стекла 3 раза в TBS в течение 5 минут для каждого мытья.
5. Вторичные антитела и лектины
   1. Выбирайте вторичные антитела в соответствии с типом первичных антител хозяина. Лектины можно смешивать со вторичными антителами и применять одновременно.
   2. Развести вторичные антитела и лектины в соответствии с рекомендациями производителя в разбавителе антител. Подробную информацию о вторичных антителах и лектинах, использованных в этом исследовании, можно найти в таблице материалов.
   3. Нанесите вторичные антитела, лектины и DAPI (1 мкг/мл) и поместите предметные стекла обратно во увлажненную камеру. Выдерживать в течение 1 ч при комнатной температуре вдали от света.
   4. Выньте предметные стекла из увлажненной камеры и промойте 3 раза TBS в течение 5 минут при каждой стирке.
6. Монтаж и подготовка к микроскопии
   1. Снимите предметное стекло с TBS и удалите лишнюю жидкость, постучав по предметному стеклу сбоку по бумажному полотенцу.
   2. Добавьте 15-20 μл монтажного материала. Держите чистый покровный лист за края и поместите один край напротив ткани, а монтажный носитель между ними.
   3. Медленно опустите покровное стекло, чтобы средство равномерно распределилось по ткани, стараясь не задерживать пузырьки.
   4. Используйте рабочую салфетку, чтобы впитать излишки монтажного материала по краям. Готовое предметное стекло высушите в темноте при комнатной температуре, прежде чем приступать к микроскопии. Повторите этот процесс для остальных слайдов.

Взрослые мыши дикого типа (WT) и MT-TGFα получали сульфат цинка (25 мМ ZnSO4) в питьевой воде в течение 2 недель до жертвоприношения. Желудки мышей WT выглядели нормальными, грубо и гистологически. В отличие от этого, желудки MT-TGFα были сильно утолщены (рис. 2А). Микроскопически эти желудки показали массивную фовеолярную гиперплазию с потерей как теменных, так и главных клеток (рисунок 2B-D), что отражает гистологические особенности болезни Менетье (МД). Потеря главных клеток может происходить двумя различными способами: гибель главных клеток или спазмолитическая полипептид-экспрессирующая метаплазия (SPEM), возникающая из главных клеток. Чтобы различить эти две возможности, мы выполнили трассировку линии главных клеток путем скрещивания Mist1-CreERT2; Мыши R26-LSL-mTmG с мышами MT-TGFα. Этих мышей сначала обрабатывали низкими дозами тамоксифена (37,5 мг/кг внутрибрюшинно в течение 7 дней подряд) для маркировки главных клеток GFP, а затем ZnSO4 в питьевой воде для индуцирования гиперэкспрессии TGFα. Мы наблюдали редкие GFP-меченые клетки у мышей MT-TGFα (данные не показаны). Кроме того, не было выявлено грубых и гистологических различий у мышей MT-TGFα в присутствии или отсутствии ZnSO4  (рисунок 3A-C). Одним из возможных объяснений этого открытия было то, что TGFα, возможно, снижал экспрессию Mist1, важного фактора транскрипции для главных клеток¹⁸, и подрывал полезность аллеля Mist1-CreERT2. Фактически, иммуногистохимическое окрашивание на Mist1 было потеряно у мышей MT-TGFα без лечения ZnSO4 (рисунок 3D).

Чтобы преодолеть негерметичность мышиной модели MT-TGFα, мы обратились к доксициклин-индуцируемой трансгенной модели Doxi-TGFa. Это было достигнуто путем скрещивания мышей TetO-TGFα¹⁴ с мышиной линией¹³ CMV-rtTA; ранее сообщалось, что ртТА экспрессируется в желудке. Мы подтвердили, что 2 недели лечения доксициклином индуцируют фовеолярную гиперплазию и снижение количества теменных и главных клеток в этой новой модели мышей с МД (рис. 4A-C). По сравнению с гистоморфологическими особенностями у мышей MT-TGFα, у мышей Doxi-TGFα наблюдалась меньшая выраженная толщина слизистых оболочек и фовеолярная гиперплазия, а также меньшее снижение париетальных клеток (дополнительный рисунок 2). Тем не менее, мы смогли проследить происхождение главных клеток с помощью мышиной линии Mist1-CreERT2 и подтвердили, что линии главных клеток также помечены GSII и CD44v9^20,21, подтвердив, что сверхэкспрессия TGFα индуцирует SPEM из главных клеток (рисунок 4D).

Настоящее исследование показывает, что мышиная модель MT-TGFα фенокопирует гистопатологические особенности МД в отсутствие лечения тяжелыми металлами, вероятно, из-за внутренней негерметичности промотора/энхансера и/или невозможности избежать воздействия тяжелых металлов (Рисунок 3 и Дополнительный рисунок 2). Поскольку TGFα подавляет экспрессию Mist1, мышиную линию Mist1-CreERT2 нельзя использовать в модели мыши MT-TGFα. Мы создали новую мышиную модель МД, в которой экспрессия TGFα может быть индуцирована лечением доксициклином. Используя эту новую мышиную модель Doxi-TGFα MD, мы смогли подтвердить, что сверхэкспрессия TGFα индуцирует SPEM, полученный из главных клеток. Мышиная модель Doxi-TGFα MD будет полезна, когда необходим точный контроль экспрессии TGFα, а также когда требуется генетическое изменение в главных клетках с использованием мышиной линии Mist1-CreERT2.

Доступность данных:

Все исходные данные доступны в виде дополнительных файлов.

Рисунок 1: Рабочий процесс фиксации и подготовки к встраиванию желудочной ткани. (A) Рассеките желудок вместе с коротким сегментом (3-5 мм) двенадцатиперстной кишки. (В) Удалите содержимое люминала, закапывая PBS из двенадцатиперстной кишки с помощью шприца с наконечником пипетки и сжимая его пальцами в 3 раза. (В) Надуйте желудок формалином из двенадцатиперстной кишки с помощью шприца и защемите гастродуоденальное соединение для удержания формалина. (D) Погрузите желудок в формалин и зафиксируйте на ночь при температуре 4 °C с помощью встряхивания. (E) Удалите преджелудок и двенадцатиперстную кишку лезвием бритвы и промойте PBS. (F) Разрежьте тело желудка и антральный отдел на 3-4 кольца в поперечном сечении и вставьте их в 2% агарозу для сохранения ориентации колец ткани желудка. (G) Поместите салфетку, залитую агарозой, в кассеты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Валовые и микроскопические фенотипы мышей MT-TGFα, получавших тяжелый металл ZnSO4. (A) Стенка желудка толще у мышей MT-TGFα (справа) по сравнению с контрольными мышами (слева). (B) Желудок мышей MT-TGFα (справа) демонстрирует массивную фовеолярную гиперплазию и потерю париетальных клеток. Желтые стрелки обозначают теменные клетки, а зеленые — фовеолярные клетки. Масштабные линейки представляют 100 мкм. (C) Иммунофлуоресцентное окрашивание подтверждает, что в желудке мыши MT-TGFα (справа) наблюдается повышенное количество фовеолярных клеток (UEA1-положительные) и SPEM-клеток (GIF и GSII двойные положительные) и уменьшенное количество париетальных клеток (H⁺/K⁺-АТФаза-положительные) и главных клеток (одиночные GIF-положительные) по сравнению с контрольным желудком мыши (слева). Масштабные линейки представляют 100 мкм. (D) Количественная оценка различных типов эпителиальных клеток и толщины слизистой оболочки у мышей дикого типа (WT), получавших ZnSO4 (n = 5), и мышей MT-TGFα с ZnSO4 (n = 3). Полосы погрешности указывают на стандартное отклонение (**p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: У мышей MT-TGFα развиваются желудочные фенотипы без лечения тяжелыми металлами. (A) Желудок мышей MT-TGFα (справа) демонстрирует массивную фовеолярную гиперплазию и потерю париетальных клеток без лечения тяжелыми металлами. Желтые стрелки обозначают теменные клетки, а зеленые — фовеолярные клетки. Масштабные линейки представляют 100 мкм. (B) Иммунофлуоресцентное окрашивание подтверждает, что желудок мыши MT-TGFα (справа) без обработки тяжелыми металлами показывает повышенное количество фовеолярных клеток (UEA1-положительные) и SPEM-клеток (GIF и GSII двойные положительные), а также уменьшенное количество париетальных клеток (H⁺/K⁺-АТФаза) и главных клеток (одинарно-положительные GIF) по сравнению с контрольным желудком мыши (слева). Масштабные линейки представляют 100 мкм. (C) Количественная оценка различных типов эпителиальных клеток и толщины слизистой оболочки у мышей WT без ZnSO4 (n = 5) и мышей MT-TGFα ZnSO4 (n = 3). Полосы погрешности указывают на стандартное отклонение (***p < 0,001, ****p < 0,0001). (D) В желудке мышей MT-TGFα (справа) наблюдается потеря экспрессии Mist1, которая в норме экспрессируется в главных клетках (слева). GSII является маркером для клеток слизистой шейки матки. Масштабные линейки представляют собой 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Мышиная модель индуцируемого доксициклином TGFα (Doxi-TGFα) повторяет фенотипы болезни Менетрие, и формирование SPEM подтверждено в этой мышиной модели. (A) Желудок от CMV-rtTA; У мышей TetO-TGFα (Doxi-TGFα; справа) наблюдается массивная фовеолярная гиперплазия и снижение количества париетальных клеток. Желтые стрелки обозначают теменные клетки, а зеленые — фовеолярные клетки. Масштабные линейки представляют 100 мкм. (B) Иммунофлуоресцентное окрашивание подтверждает, что желудок мыши Doxi-TGFα (справа) показывает повышенное количество фовеолярных клеток (UEA1-положительные) и SPEM-клеток (GIF и GSII двойные положительные), а также уменьшенное количество париетальных клеток (H⁺/K⁺-АТФаза-положительных) и главных клеток (GIF одиночно-положительные) по сравнению с контрольным желудком мыши (слева). Масштабные линейки представляют собой 100 мкм. (C) Количественная оценка различных типов эпителиальных клеток и толщины слизистой оболочки у мышей WT (n = 5) и мышей Doxi-TGFα (n = 5). Полосы погрешности указывают на стандартное отклонение (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). (D) Отслеживание линии главных клеток (GFP-положительный) с использованием Mist1-CreERT2; Линия мышей R26-LSL-mTmG показывает, что GFP-положительные клетки также положительны на GSII и CD44v9 в желудке мыши Doxi-TGFα, подтверждая образование SPEM, полученное из главных клеток, в то время как в контрольном желудке (слева) почти нет GFP-положительных клеток, которые также положительны на GSII или CD44v9. Масштабные линейки представляют 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Лечение низкими дозами тамоксифена (TMX) не вызывает повреждения слизистой оболочки желудка. Семь дней подряд лечения низкими дозами TMX (37,5 мг/кг) не вызывают повреждения слизистой оболочки желудка, примером чего является поддержание числа париетальных клеток. (A) Репрезентативные изображения H&E без обработки TMX (левая панель) и с обработкой TMX (правая панель). Масштабные линейки представляют 100 мкм. (B) Количественная оценка количества париетальных клеток на желудочную единицу у мышей WT (n = 5) и WT при лечении TMX (n = 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Сравнение фенотипов среди различных моделей мышей с болезнью Менетье (МД). (A) Модели MT-TGFα с обработкой ZnSO4, MT-TGFα без обработки ZnSO4 и Doxi-TGFα MD демонстрируют фовеолярную гиперплазию, потерю париетальных и главных клеток, увеличение спазмолитической полипептид-экспрессирующей метаплазии (SPEM) клеток (ко-локализованные клетки GIF и GSII) и утолщение слизистой оболочки. Фенотипических различий между MT-TGFα с группами лечения ZnSO4 и без них нет. Мышиная модель Doxi-TGFα демонстрирует менее выраженные фенотипы, чем мышиная модель MT-TGFα. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Болезнь Менетье (БМ) — редкое предраковое заболевание желудка, вызванное сверхэкспрессией TGFα ^1,2,3. Трансгенные мыши с гиперэкспрессией TGFα под контролем энхансера/промотора гена металлотионеина (MT-TGFα) на сегодняшний день являются единственной мышиной моделью для МД ^4,5. Поскольку ген металлотионеина реагирует на тяжелые металлы, сульфат цинка добавляют в питьевую воду или вводят сульфат кадмия для индукции TGFα в этой модели мышей ^5,8. Одним из характерных фенотипов при МД является замещение главных клеток в основании желудочных желез муцинозными клетками, положительными на маркеры, присутствующие как в клетках слизистой шеи, так и в клетках антрального муцина. Это может произойти либо в результате гибели главных клеток, либо в результате перепрограммирования главных клеток на спазмолитическую метаплазию, экспрессирующую полипептиды (SPEM)^8,11. Это можно проверить с помощью отслеживания линии главных клеток на мышиной модели МД. Мы попытались проследить происхождение главных клеток с помощью Mist1-CreERT2; Мыши R26-LSL-mTmG, у которых Mist1-положительные главные клетки помечены мембранно-ориентированным GFP. Тем не менее, мы наблюдали лишь ограниченное количество GFP-меченых клеток у мышей MT-TGFα. Это говорит о том, что либо большинство меченых GFP главных клеток погибли из-за сверхэкспрессии TGFα, либо эффективность мечения GFP в главных клетках была слишком низкой. Поскольку сообщалось, что не было увеличения гибели клеток из-за^{сверхэкспрессии} TGFα8, мы изучили возможность потери экспрессии Mist1, оценивая мышей MT-TGFα без обработки тяжелыми металлами. Мы были удивлены полными фенотипами у мышей MT-TGFα без лечения тяжелыми металлами, включая фовеолярную гиперплазию и потерю париетальных и главных клеток. Мы также подтвердили, что экспрессия Mist1 теряется у мышей MT-TGFα даже без обработки тяжелыми металлами. Ранее сообщалось, что экспрессия TGFα у мышей MT-TGFα строго не контролировалась из-за неспособности устранять воздействие тяжелых металлов; однако экспрессия TGFα была значительно увеличена при обработке тяжелыми металлами⁸. Всесторонняя фенотипическая оценка ранее не проводилась у мышей MT-TGFα без обработки тяжелыми металлами. Текущее исследование показывает, что у мышей MT-TGFα развивается полное фенотипическое проявление без обработки тяжелыми металлами.

Поскольку экспрессия Mist1 была утрачена у мышей MT-TGFα еще до обработки тяжелыми металлами, оставалась необходимость в другой мышиной модели, в которой экспрессия TGFα специфически контролируется, чтобы фенотипы не развивались без индукции сверхэкспрессии TGFα. Мы создали новую мышиную модель МД, в которой экспрессия TGFα индуцируется лечением доксициклином (Doxi-TGFα). Мы подтвердили, что эта мышиная модель индуцирует фовеолярную гиперплазию и потерю теменных и главных клеток, которые являются основными фенотипами МД. Мы смогли определить линию следовых главных клеток с помощью Mist1-CreERT2; R26-LSL-mTmG мышей в этой мышиной модели и обнаружили, что некоторые GFP-меченые клетки также были помечены GSII и CD44v9, подтверждая, что SPEM имеет место в этой новой модели мыши MD. Это первое сообщение, подтверждающее, что SPEM развивается в желудке с гиперэкспрессией TGFα. SPEM является более распространенным предраковым заболеванием желудка, которое может быть причиной увеличения рака желудка у пациентов с МД^22,23.

Одним из предостережений при использовании линии мышей Mist1-CreERT2 является то, что сообщалось, что Mist1 также может экспрессироваться в стволовых клетках желудка²⁴. Мы обнаружили, что низкая доза (37,5 мг/кг) тамоксифена вызывает активацию Cre, более конкретно в главных клетках, с минимальной активацией в области перешейка даже в более ранние моменты времени до лечения доксициклином. Ранее сообщалось о подобных выводах²⁵. Трассировка родословной с помощью Mist1-CreERT2; У мышей R26-LSL-mTmG наблюдаются GFP-положительные клетки вблизи GFP и SPEM-маркера (GSII и CD44v9) двойные положительные клетки в основном локализованы в основании, где расположены главные клетки (рис. 4C). Если от стволовых клеток прослеживаются двойные положительные маркеры GFP и SPEM, то в направлении перешейка, где расположены стволовые клетки, должно было быть больше GFP-положительных клеток. В качестве альтернативы, индуцируемые доксициклином GIF-rtTA мыши линии²⁶ или GPR30-rtTA мыши линии²⁷ могут быть использованы вместе с мышами MT-TGFα для генетических модификаций или отслеживания линии главных клеток. Тем не менее, GIF-положительные клетки уменьшаются у мышей MT-TGFα без лечения ZnSO4 (рис. 3B, C), а GPR30-положительные клетки теряются при SPEM, что происходит у мышей MT-TGFα без лечения ZnSO4. Поэтому они будут менее эффективны по сравнению с мышами Doxi-TGFα, скрещенными с линией мышей Mist1-CreERT2.

Текущее исследование показывает, что у мышей MT-TGFα развиваются полные фенотипические изменения в желудке без лечения тяжелыми металлами. Мы также показываем, что одним из фенотипов является потеря экспрессии Mist1, и это исключает использование Mist1-CreERT2; R26-LSL-mTmG от линии мыши к основным клеткам следа линии. Мы создали новую мышиную модель МД, Doxi-TGFα, и впервые подтвердили, что SPEM развивается в МД, используя эту мышиную модель. Эта новая мышиная модель МД будет полезна, когда необходим точный контроль за развитием фенотипов МД и когда необходимы генетические модификации в основных клетках с использованием линии мышей Mist1-CreERT2. Фенотипы МД индуцируются активацией сигнализации EGFR за счет сверхэкспрессии TGFα. Тем не менее, неизвестна активация EGFR, в каких типах клеток ответственны за наблюдаемые фенотипы. Используя мышиную модель Doxi-TGFα, мы в настоящее время исследуем роль передачи сигналов EGFR в различных типах клеток, включая главные клетки, использующие мышиную линию Mist1-CreERT2.

У всех авторов нет конфликта интересов, который можно раскрыть.

Эта работа была поддержана Национальным институтом диабета, болезней пищеварительной системы и почек (K08 DK124686 to WJH). Мы благодарим Джину Делла Порта и Сару Э. Гласс за редактирование рукописи.

Вклад автора:
TTG проводила эксперименты, генерировала рисунки, писала рукопись и редактировала рукопись. JDP проводила эксперименты, генерировала цифры, писала рукопись и редактировала рукопись. SKM предоставила линию мышей TetO-TGFα и отредактировала рукопись. RJC задумал эксперименты и отредактировал рукопись. WJH придумывал эксперименты, проводил эксперименты, интерпретировал данные, искал литературу, писал рукопись и редактировал рукопись.