Почечная заготовка в доклинической модели крупного животного

В данной статье мы представляем протокол, в котором подробно описывается хирургическая модель получения почки в доклинической модели свиньи для последующей машинной перфузии или трансплантации.

Машинная перфузия превратилась в жизнеспособную стратегию для оценки, мониторинга, лечения и оптимизации органов ex vivo , а также для продления срока хранения. Модели крупных животных имели первостепенное значение для развития и оптимизации этих технологий. Тем не менее, для обеспечения качества трансплантата и воспроизводимости данных следует придерживаться стандартизированных и клинически переводимых хирургических методов заготовки органов и тканей. Таким образом, здесь мы описываем оптимизированный протокол закупки почек в доклинической модели свиней. Восстановление почек проводится с использованием свиней смешанной породы (йоркширский кросс/микс). Вкратце, после стерильной дезинфекции и драпировки операционного поля, выполняется полный разрез по средней линии для обеспечения оптимального доступа к обеим почкам. Мочеточник, почечная вена и артерия рассекаются до тех пор, пока они не выйдут из нижней полой вены и аорты соответственно. После полной почечной диссекции мочеточник перевязывают и разрезают дистально. Затем донорское животное полностью гепаринизируется с концентрацией 100 МЕ на кг/массу тела. Далее почечная артерия пережимается вплотную к аорте, а почечная вена пережимается вплотную к полой вене с помощью сосудистого зажима Сатинского. Затем почечный трансплантат резецируется, а почечная артерия немедленно канюлируется на заднем столе. Затем почка будет промыта ледяным консервационным раствором и храниться на льду до аппаратной перфузии или трансплантации. Наконец, культя почечной артерии перевязывается шелковой лигатурой 2-0, а полая вена закрывается полипропиленовым швом 6-0. Этот метод восстанавливает почки и моделирует либо живого (одна почка), либо мертвого (две почки) донора. Восстановление одной почки дает преимущество для проведения последующей аутотрансплантации. В модели умершего донора кровь может быть собрана до эвтаназии путем введения игл для мешка с кровью непосредственно в аорту, тем самым обескровливая животное и обеспечивая кровь для перфузии ex vivo с помощью аппарата.

Трансплантация почки является оптимальным методом лечения терминальной стадии почечной недостаточности (ТХПН), обеспечивая улучшение качества жизни и долгосрочные результаты по сравнению с диализом¹. Несмотря на достижения в области сохранения органов, десятки людей умирают каждый день от ТХПН, находясь в списке ожидания на пересадку почки^. Аппаратная перфузия — это растущая область, которая увеличивает время хранения, позволяя расширить донорские сети и более эффективно распределять органы. Эта технология также позволяет осуществлять мониторинг и оптимизацию органов ex vivo, тем самым сводя к минимуму последствия ишемии-реперфузионного повреждения (ИРИ). По сравнению со статическим холодным хранением (SCS), было показано, что машинная перфузия значительно снижает частоту задержки функции трансплантата ^3,4. Аппаратная перфузия также продемонстрировала оживление маргинальных графтов, которые в противном случае не соответствовали бы критериям для трансплантации⁵. Несмотря на технический прогресс, наиболее распространенным методом консервации остается СКС на льду. Дальнейшие доклинические эксперименты и данные могут помочь сделать машинную перфузию основой сохранения почек.

Модель трансплантации почки на свиньях хорошо известна и является неотъемлемой частью развития технологии сохранения почек, особенно машинной перфузии. В отличие от однолобулярных почек грызунов, почки свиньи и человека являются многодольчатыми, схожими по размеру и имеют аналогичную артериальную, венозную и мочевую анатомию ^6,7. Таким образом, свиная почка способствует прямому переносу в клинические условия, особенно с точки зрения медицинских устройств и лекарственной терапии. Кроме того, почки свиньи демонстрируют такую же патофизиологию^{IRI, как} и почки человека8, что делает их идеальными для исследований по сохранению почек.

Для обеспечения качества трансплантата и воспроизводимости данных необходимо применять стандартизированные и клинически переводимые хирургические методы заготовки органов и тканей. Таким образом, здесь мы описываем оптимизированный протокол закупки почек в доклинической модели свиней. Этот протокол позволяет восстановить почки и имитирует состояние живого (одна почка) или мертвого (две почки) донора. Восстановление одной почки дает преимущество в проведении последующей аутотрансплантации. В модели восстановления двойной почки забор крови перед эвтаназией возможен путем введения игл из мешка с кровью непосредственно в аорту, тем самым обескровливая животное и обеспечивая кровь для перфузии ex vivo аппаратом.

Все описанные процедуры были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию Университета Джона Хопкинса, лицензированным Министерством сельского хозяйства США (USDA), застрахованным Управлением по благополучию лабораторных животных (OLAW) и аккредитованным Ассоциацией по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными (AAALAC). Содержание животных осуществлялось в соответствии с Законом о защите животных Министерства сельского хозяйства США, Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованием, а также Политикой Службы общественного здравоохранения США по гуманному уходу за лабораторными животными и их использованию.

1. Животные и жилье

1. Для этого протокола используйте 3-6-месячных клинически здоровых йоркширских свиней весом 20-40 кг (Sus scrofa domesticus) или сопоставимых.
2. Размещайте животных в сетчатых ограждениях с решетчатым настилом.

2. Предоперационная процедура и анестезия

1. Голодайте на животном не менее чем за 12 часов до времени седации.
2. Применяйте перорально симетикон (20 мг/кг) не менее чем за 12 ч до операции и повторите прием не менее чем за 1 ч до седации для уменьшения дилатации кишечника.
3. Вводите кетамин (20-30 мг/кг) и ксилазин (2-3 мг/кг) в один шприц внутримышечно, чтобы избежать многократных инъекций.
4. Переведите свинью в зону предоперационной стадии. Установите внутривенный катетер в краевую ушную вену. Вводите 3-10 мг/кг/ч 0,9% физиологического раствора или раствора лактата Рингера на протяжении всей процедуры.
5. После того, как свинья будет должным образом успокоена, необходимо установить эндотрахеальную трубку (эндотрахеальная трубка с манжетой 6,0-6,5 мм для животного весом 20-30 кг; 6,5-7,0 мм с манжетой для 30-40 кг) для введения газовой анестезии и искусственной вентиляции легких. При необходимости облегчить введение дозы пропофола (0,8-1,66 мг/кг) внутривенно, ввести для достижения эффекта.
6. Удалите шерсть на месте операции и вокруг него с помощью машинки для стрижки, а также грязного скраба с места операции, прежде чем переместить животное в операционную.
7. Перенесите животное на операционный стол. Введите цефазолин (20-22 мг/кг) внутривенно за 10 минут до начала операции и повторно каждые 90 минут интраоперационно. Введите пантопразол (0,5-1 мг/кг) внутривенно в начале операции.
8. Введите местную блокаду подкожно с лидокаином (до 2 мг/кг) для облегчения дополнительной анальгезии перед разрезом.
9. Асептически подготовьте место операции, чередуя хлоргексидин или бетадин с 70% этанолом или физиологическим раствором, по крайней мере, три раза.
10. Непрерывно контролируйте объем жидкости, частоту сердечных сокращений, артериальное давление, пульсоксиметрию, капнографию, электрокардиографию и температуру прямой кишки. Записывайте эти значения каждые 10-15 минут. Используйте подогреваемую подушку для нижней части тела и одеяло с теплым воздухом, чтобы предотвратить переохлаждение.
11. Перед началом операции убедитесь, что животное находится в подходящей плоскости хирургической анестезии, используя комбинацию тонуса челюсти, пальпебрального рефлекса и параметров, перечисленных на предыдущем этапе.

3. Процедура забора почки

1. Подготовьте животное к операции, следуя шагам, описанным в разделе 2.
2. После стерильной дезинфекции и драпировки операционного поля выполните срединную лапаротомию (25-30 см) для обеспечения оптимального доступа к обеим почкам. Вставьте стандартный абдоминальный ретрактор.
3. Накройте толстую кишку и тонкую кишку полотенцами, смоченными в теплом физрастворе. Втяните кишечник либо в правую сторону, чтобы получить доступ к левой почке, либо в левую, чтобы получить доступ к правой почке.
4. Откройте брюшину, расположенную над почкой, и рассеките вокруг почки, чтобы освободить любые спайки. Рассекайте мочеточник до тех пор, пока не получится 10-12 см длины.
5. Рассекайте почечную вену и артерию до их истока из нижней полой вены и аорты соответственно.
6. После полной почечной диссекции завяжите мочеточник дистально шелковой лигатурой 2-0 и разрежьте проксимально к завязке. Оставьте проксимальный конец мочеточника открытым, чтобы обеспечить отток мочи.
7. Гепаринизируйте животное внутривенно гепарином (100 МЕ/кг) и подождите 2 мин для обеспечения адекватной гепаринизации почки. Этот шаг следует повторить перед резекцией каждой почки.
8. Пережмите почечную артерию и почечную вену вплотную к аорте и нижней полой вене соответственно двумя сосудистыми зажимами Сатинского. Удалите почечный трансплантат, перерезав почечную артерию и вену рядом с зажимами.
9. Немедленно канюлируйте почечную артерию с помощью перфузионной канюли с тупым кончиком толщиной 3 мм. Промойте почку ледяным раствором Висконсинского университета (UW) или раствором для консервации Custodiol Histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK).
10. Извлеките перфузионную канюлю после промывания с помощью UW или HTK и поместите почку в стерильный мешок для органов, наполненный тем же раствором для консервации ледяного льда, который использовался для промывания почки. Поместите этот мешок во второй стерильный мешок для органов. Впоследствии храните орган или инициируйте аппаратную перфузию.
11. Перевязать культю почечной артерии шелковой лигатурой 2-0. Закройте культю почечной вены двухслойным беговым швом с полипропиленом 6-0.

4. Процедура забора крови

1. Если процедура является терминальной и все остальные хирургические вмешательства уже выполнены, приступайте к забору крови для аппаратной перфузии и эвтаназии путем обескровливания.
2. Втяните кишечник в правую сторону и определите инфраренальную брюшную аорту. Освободите любые крупные спайки или ткань, покрывающую сосуд.
3. Введите иглу для мешка для сбора крови непосредственно в аорту. Повесьте мешок под животное, чтобы облегчить наполнение. Как только мешок заполнится (примерно 450 мл крови), извлеките иглу из аорты и удерживайте давление на месте прокола.
4. Для второго пакета с кровью введите новую иглу на 1-2 см проксимальнее предыдущего места прокола. При необходимости повторите то же самое с несколькими пакетами с кровью, перемещаясь на 1-2 см проксимально с каждой иглой.
5. После сбора всей необходимой крови вызвать остановку сердца путем внутривенного введения пентобарбитала натрия/фенитоина натрия в дозе не менее 78 мг/кг компонента пентобарбитала. Если есть опасения, что пентобарбитал помешает последующим анализам почки, используйте хлорид калия (KCl) (75-100 мг/кг внутривенно) в качестве альтернативного метода химической эвтаназии, если он вводится свиньям под анестезией. Подтвердите смерть из-за отсутствия сердцебиения, отсутствия роговичного рефлекса и значительного снижения температуры тела.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшиеся органы и ткани умерщвленной свиньи могут быть использованы для других исследовательских или образовательных целей в соответствии с принципами 3R.

Наша исследовательская группа имеет обширный опыт, охватывающий почти 15 лет, с моделями свиней как трансплантации солидных органов, так и васкуляризированной композитной аллотрансплантации 9,10,11,12,13,14,15,16,17

Модель свиньи для трансплантации почки сыграла жизненно важную роль в развитии и оптимизации технологии машинной перфузии. Учитывая анатомическое, иммунологическое и патофизиологическое сходство с человеческими почками ^6,7,8

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Авторы выражают признательность многим ветеринарным техникам из Медицинской школы Университета Джона Хопкинса за их техническую помощь. Мы также хотели бы выразить нашу благодарность докторам Джессике Иззи и Аманде Максвелл, а также многочисленным ветеринарным ординаторам, включая докторов Мэллори Браун, Джессику Планкард и Алексис Роуч, за предоставление нашим животным отличного клинического ухода и ветеринарного надзора. Наконец, мы хотели бы выразить признательность всем сотрудникам Лаборатории васкуляризированной композитной аллотрансплантации (VCA) Медицинской школы Джона Хопкинса, которые оказали помощь в любом качестве при заборе почек или других процедурах забора органов, выполненных в нашей лаборатории. Эта работа была поддержана грантом Национального института диабета, болезней пищеварительной системы и почек (NIDDK) R44DK136396.