شراء الكلى في نموذج حيواني كبير قبل السريري

هنا ، نقدم بروتوكولا يوضح بالتفصيل نموذجا جراحيا لشراء الكلى في نموذج الخنازير قبل السريرية للتروية أو الزرع الآلي اللاحق.

تطورت التروية الآلية كاستراتيجية قابلة للتطبيق لتقييم الأعضاء خارج الجسم الحي ومراقبتها وعلاجها وتحسينها ، بالإضافة إلى إطالة أوقات الحفظ. كانت النماذج الحيوانية الكبيرة ذات أهمية قصوى لتطوير هذه التقنيات وتحسينها. ومع ذلك ، من أجل ضمان جودة الكسب غير المشروع وقابلية استنساخ البيانات ، يجب اتباع التقنيات الجراحية الموحدة والقابلة للترجمة سريريا لشراء الأعضاء والأنسجة. وبالتالي ، هنا ، نصف بروتوكولا محسنا لشراء الكلى في نموذج الخنازير قبل السريرية. يتم إجراء استعادة الكلى باستخدام خنازير السلالات المختلطة (يوركشاير كروس / ميكس). باختصار ، بعد التطهير المعقم ولفة المجال الجراحي ، يتم إجراء شق كامل في خط الوسط للحصول على الوصول الأمثل إلى كلتا الكليتين. يتم تشريح الحالب والوريد الكلوي والشريان حتى أصلهم من الوريد الأجوف السفلي والشريان الأورطي ، على التوالي. بعد التشريح الكلوي الكامل ، يتم ربط الحالب وقطعه بعيدا. ثم يتم إضفاء الطابع الهباريني على المتبرع بالكامل ب 100 وحدة دولية لكل كيلوغرام / وزن الجسم. بعد ذلك ، يتم تثبيت الشريان الكلوي بالقرب من الشريان الأورطي ، ويتم تثبيت الوريد الكلوي بالقرب من الوريد الأجوف باستخدام مشبك الأوعية الدموية ساتينسكي. ثم يتم استئصال الطعم الكلوي ، ويتم تقشير الشريان الكلوي على الفور على الطاولة الخلفية. سيتم بعد ذلك شطف الكلية بمحلول حفظ مثلج وتخزينها على الثلج حتى يتم التروية أو الزرع. أخيرا ، يتم ربط جذع الشريان الكلوي برباط حريري 2-0 ، ويتم إغلاق الوريد الأجوف بخياطة 6-0 من مادة البولي بروبلين. تستعيد هذه التقنية الكلى وتحاكي إما بيئة متبرع حي (كلية واحدة) أو متبرع متوفى (كلية مزدوجة). يوفر التعافي من الكلى الفردية ميزة إجراء عملية زرع ذاتي لاحقة. في نموذج المتبرع المتوفى ، يمكن جمع الدم قبل القتل الرحيم عن طريق إدخال إبر كيس الدم مباشرة في الشريان الأورطي ، وبالتالي إخراج وتوفير الدم لتروية آلة خارج الجسم الحي .

زراعة الكلى هي العلاج الأمثل لمرض الكلى في المرحلة النهائية (ESRD) ، مما يوفر نوعية حياة محسنة ونتائج طويلة المدى مقارنة بغسيل^{الكلى 1}. على الرغم من التقدم في الحفاظ على الأعضاء ، يموت عشرات الأشخاص كل يوم من ESRD أثناء وجودهم في قائمة الانتظار لزراعة الكلى². التروية الآلية هي مجال متنام يزيد من أوقات الحفظ ، مما يتيح شبكات المتبرعين الموسعة وتخصيص الأعضاء بشكل أكثر كفاءة. تسمح هذه التقنية أيضا بمراقبة الأعضاء خارج الجسم الحي وتحسينها ، وبالتالي تقليل آثار إصابة نقص التروية وإعادة التروية (IRI). عند مقارنتها بالتخزين البارد الثابت (SCS) ، فقد ثبت أن نضح الماكينة يقلل بشكل كبير من حدوث وظيفة الكسب غير المشروع المتأخرة^3،4. أظهر التروية الآلية أيضا تنشيط الطعوم الهامشية ، والتي لم تكن لتفي بمعايير الزرع⁵. على الرغم من التقدم التكنولوجي ، تظل تقنية الحفظ الأكثر شيوعا SCS على الجليد. يمكن أن تساعد المزيد من التجارب والبيانات قبل السريرية في جعل التروية الآلية الدعامة الأساسية للحفاظ على الكلى.

نموذج الخنازير لزراعة الكلى راسخ وكان جزءا لا يتجزأ من تطوير تقنية الحفاظ على الكلى ، وخاصة نضح الآلة. على عكس الكلى القوارض غير الضاربة ، فإن الخنازير والكلى البشرية كلاهما متعدد الفصوص ، ومتشابهة في الحجم ، ويشتركان في تشريح الشرياني والوريدي والبول^{المماثل 6،7}. لذلك ، تسهل كلية الخنازير الترجمة المباشرة إلى البيئة السريرية ، خاصة فيما يتعلق بالأجهزة الطبية والعلاجات الدوائية. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر كلى الخنازير فيزيولوجيا مرضية مماثلة للكلى البشرية⁸ ، مما يجعلها مثالية لدراسات الحفاظ على الكلى.

من أجل ضمان جودة الكسب غير المشروع وقابلية تكرار البيانات ، يجب اتباع التقنيات الجراحية الموحدة والقابلة للترجمة سريريا لشراء الأعضاء والأنسجة. وبالتالي ، هنا ، نصف بروتوكولا محسنا لشراء الكلى في نموذج الخنازير قبل السريرية. يسمح هذا البروتوكول باستعادة الكلى ويحاكي إما بيئة متبرع حي (كلية واحدة) أو متبرع متوفى (كلية مزدوجة). يوفر التعافي الكلوي الفردي ميزة إجراء عملية زرع ذاتي لاحقة. في نموذج استعادة الكلى المزدوجة ، يمكن جمع الدم قبل القتل الرحيم عن طريق إدخال إبر كيس الدم مباشرة في الشريان الأورطي ، وبالتالي إخراج وتوفير الدم لتروية آلة خارج الجسم الحي .

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة من قبل لجنة الرعاية المؤسسية والاستخدام بجامعة جونز هوبكنز ، وهي مؤسسة مرخصة من وزارة الزراعة الأمريكية (USDA) ، ومكتب رعاية المختبر (OLAW) المضمونة ، وجمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر (AAALAC) مؤسسة معتمدة. تم الحفاظ على وفقا لقانون رعاية الصادر عن وزارة الزراعة الأمريكية ، ودليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر ، وسياسة خدمة الصحة العامة الأمريكية بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر.

1. والسكن

1. استخدم خنازير يوركشاير البالغة من العمر 3-6 أشهر وعمرها 20-40 كجم (Sus scrofa domesticus) ، أو قابلة للمقارنة ، لهذا البروتوكول.
2. ضع في سياج ربط سلسلة مع أرضيات شرائحية.

2. إجراء ما قبل الجراحة والتخدير

1. صيام قبل 12 ساعة على الأقل من وقت التخدير.
2. يجب تطبيق سيميثيكون عن طريق الفم (20 ملغ/كغ) قبل 12 ساعة على الأقل من الجراحة وتكرار الجرعات قبل 1 ساعة على الأقل من التخدير لتقليل تمدد الأمعاء.
3. يتم تطبيق الكيتامين (20-30 ملغ/كغ) والزيلازين (2-3 ملغ/كغ) في حقنة واحدة في الحقن العضلية لتجنب الحقن المتعددة.
4. انقل الخنزير إلى منطقة التدريج قبل الجراحة. ضع قسطرة وريدية في وريد الأذن الهامشية. تطبيق 3-10 ملغ/كغ/ساعة من محلول ملحي 0.9٪ أو محلول رينجر مرهب طوال العملية.
5. بمجرد تخدير الخنزير بشكل كاف ، ضع أنبوبا قصغايا (أنبوب بطاني قصغامي 6.0-6.5 مم لحيوان 20-30 كجم ؛ 6.5-7.0 مم مكبل لمدة 30-40 كجم) لتوصيل التخدير بالغاز والتهوية الميكانيكية. إذا لزم الأمر، يتم تسهيل جرعة البروبوفول (0.8-1.66 ملغم/كغ) عن طريق الوريد، تدار لتأثيرها.
6. قم بإزالة الشعر الموجود على موقع الجراحة ومحيطه باستخدام المقص ، بالإضافة إلى فرك متسخ لموقع الجراحة ، قبل نقل إلى غرفة العمليات.
7. انقل إلى طاولة العمليات. يجب تطبيق سيفازولين (20-22 مجم / كغ) عن طريق الوريد قبل 10 دقائق من بدء الجراحة ومرة أخرى كل 90 دقيقة أثناء الجراحة. يتم تطبيق بانتوبرازول (0.5-1 مجم / كجم) عن طريق الوريد في بداية الجراحة.
8. يتم تطبيق إحصاد موضعي تحت الجلد مع الليدوكائين (حتى 2 ملغ/كغ) لتسهيل التسكين الإضافي قبل الشق.
9. قم بإعداد موقع الجراحة بشكل معقم ، بالتناوب بين الكلورهيكسيدين أو البيتادين و 70٪ من الإيثانول أو المحلول الملحي ، ثلاث مرات على الأقل.
10. مراقبة حجم السوائل ومعدل ضربات القلب وضغط الدم وقياس التأكسج النبضي وتصوير الكبنومات وتخطيط كهربية القلب ودرجة حرارة المستقيم باستمرار. سجل هذه القيم كل 10-15 دقيقة. استخدم وسادة سفلية ساخنة وبطانية بالهواء الدافئ لمنع انخفاض حرارة الجسم.
11. قبل بدء الجراحة ، تأكد من أن ضمن المستوى المناسب للتخدير الجراحي من خلال استخدام مزيج من نغمة الفك ، وانعكاس الجفن ، والمعلمات المذكورة في الخطوة السابقة.

3. إجراء حصاد الكلى

1. جهز للجراحة باتباع الخطوات الموضحة في القسم 2.
2. بعد التطهير المعقم ولفة المجال الجراحي ، قم بإجراء بضع البطن المتوسط (25-30 سم) للوصول الأمثل إلى كلتا الكليتين. أدخل ضام بطن قياسي.
3. غطي القولون والأمعاء الدقيقة بمناشف مبللة بمحلول ملحي دافئ. اسحب الأمعاء إلى الجانب الأيمن للوصول إلى الكلية اليسرى أو إلى الجانب الأيسر للوصول إلى الكلية اليمنى.
4. افتح الصفاق المغطى بالكلى وقم بتشريح حول الكلى لتحرير أي التصاقات. تشريح الحالب حتى يتم الحصول على طول 10-12 سم.
5. تشريح الوريد الكلوي والشريان حتى أصلهما من الوريد الأجوف السفلي والشريان الأورطي ، على التوالي.
6. بعد التشريح الكلوي الكامل ، اربط الحالب بعيدا برباط حريري 2-0 واقطع بالقرب من ربطة العنق. اترك طرف الحالب القريب مفتوحا للسماح بتصريف البول.
7. هيبارين بالهيبارين الوريدي (100 وحدة دولية / كجم) وانتظر لمدة دقيقتين لضمان الهيبارين الكافي للكلى. يجب تكرار هذه الخطوة قبل استئصال كل كلية.
8. قم بتثبيت الشريان الكلوي والوريد الكلوي بالقرب من الشريان الأورطي والوريد الأجوف السفلي ، على التوالي ، باستخدام مشابك الأوعية الدموية ساتينسكي. قم بإزالة طعم الكلى عن طريق قطع الشريان الكلوي والوريد بالقرب من المشابك.
9. قم بتقشير الشريان الكلوي على الفور باستخدام قنية نضحية ذات طرف حاد 3 مم. اغسل الكلى بمحلول جامعة ويسكونسن المثلج (UW) أو محلول الحفاظ على Custodiol Histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK).
10. قم بإزالة قنية التروية بعد التنظيف باستخدام UW أو HTK وضع الكلية في كيس معقم مملوء بنفس محلول الحفظ المثلج الذي تم استخدامه لتنظيف الكلى. ضع هذا الكيس داخل كيس عضو معقم ثان. بعد ذلك قم بتخزين العضو أو بدء تروية الجهاز.
11. اربط جذع الشريان الكلوي برباط حريري 2-0. أغلق جذع الوريد الكلوي بخياطة جري من طبقتين ب 6-0 بولي بروبيلين.

4. إجراء حصاد الدم

1. إذا كان الإجراء نهائيا وتم إجراء جميع التدخلات الجراحية الأخرى ، فاستمر في حصاد الدم من أجل التروية الآلية والقتل الرحيم عن طريق الاستئصال.
2. اسحب الأمعاء إلى الجانب الأيمن وحدد الشريان الأورطي البطني تحت الكلى. حرر أي التصاقات كبيرة أو أنسجة تغطي الوعاء.
3. أدخل إبرة كيس جمع الدم مباشرة في الشريان الأورطي. الكيس أسفل لتسهيل التعبئة. بمجرد امتلاء الكيس (حوالي 450 مل من الدم) ، قم بإزالة الإبرة من الشريان الأورطي واضغط على موقع البزل.
4. للحصول على كيس دم ثان ، أدخل الإبرة الجديدة على بعد 1-2 سم بالقرب من موقع البزل السابق. كرر العملية باستخدام أكياس دم متعددة حسب الحاجة ، مع تحريك 1-2 سم بالقرب من كل إبرة.
5. بعد جمع جميع الدم اللازم ، قم بتحفيز السكتة القلبية بالحقن الوريدي من الصوديوم البنتوباربيتال / الفينيتوين الصوديوم بجرعة لا تقل عن 78 مجم / كجم من مكون البنتوباربيتال. إذا كان هناك قلق من أن البنتوباربيتال سيتداخل مع المقايسات اللاحقة للكلى ، فاستخدم كلوريد البوتاسيوم (KCl) (75-100 مجم / كجم IV) كطريقة بديلة للقتل الرحيم الكيميائي إذا تم إعطاؤه للخنازير تحت التخدير. تحقق من الوفاة بسبب قلة ضربات القلب ، وغياب منعكس القرنية ، وانخفاض كبير في درجة حرارة الجسم.
   ملاحظة: يمكن استخدام الأعضاء والأنسجة المتبقية من الخنزير المضحى به لأغراض بحثية أو تعليمية أخرى وفقا لمبادئ 3R.

تتمتع مجموعتنا البحثية بخبرة واسعة تمتد لما يقرب من 15 عاما مع نماذج الخنازير لكل من زراعة الأعضاء الصلبة وزرع الأوعية الدموية المركبة^{9،10،11،12،13،14،}

كان نموذج الخنازير لزراعة الكلى أمرا حيويا لتطوير وتحسين تقنية التروية الآلية. بالنظر إلى أوجه التشابه التشريحية والمناعية والفيزيولوجية المرضية مع الكلى البشرية^6،7،8 ، تقدم كلى الخنازير ترجمة ميسرة للاختبارات السرير...

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم للعديد من الفنيين البيطريين في كلية الطب بجامعة جونز هوبكنز لمساعدتهم الفنية. نود أيضا أن نعرب عن امتناننا للدكتورة جيسيكا إيزي وأماندا ماكسويل ، والعديد من المقيمين البيطريين ، بما في ذلك الدكتورة مالوري براون وجيسيكا بلونكارد وأليكسيس روتش لتزويد حيواناتنا برعاية سريرية ممتازة وإشراف بيطري. أخيرا ، نود أن نتوجه بخالص الشكر إلى جميع أعضاء مختبر زراعة الأوعية الدموية المركبة (VCA) في كلية الطب بجامعة جونز هوبكنز الذين ساعدوا بأي صفة في شراء الكلى أو إجراءات شراء الأعضاء الأخرى التي يتم إجراؤها في مختبرنا. تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK) R44DK136396.