临床前大型动物模型中的肾脏获取

在这里，我们提出了一个协议，该协议详细说明了临床前猪模型中用于后续机器灌注或移植的肾脏获取手术模型。

机器灌注已发展成为离 体 器官评估、监测、治疗、优化以及延长保存时间的可行策略。大型动物模型对于这些技术的开发和优化至关重要。然而，为了确保移植物质量和数据可重复性，应遵循标准化和临床可转化的器官和组织获取手术技术。因此，在这里，我们描述了临床前猪模型中肾脏采购的优化方案。使用混种（约克郡杂交/混交）猪进行肾脏恢复。简而言之，在对手术区域进行无菌消毒和悬垂后，进行完整的中线切口，以获得进入双肾的最佳通路。解剖输尿管、肾静脉和动脉，直到它们分别起源于下腔静脉和主动脉。完全肾清扫后，结扎输尿管并向远端切开。然后用每公斤/体重 100 IU 的浓度将供体动物完全肝素化。接下来，将肾动脉夹在靠近主动脉的位置，并使用 Satinsky 血管夹将肾静脉夹在靠近腔静脉的位置。然后切除肾移植物，并立即在肾动脉背台插管。然后用冰冷的保存溶液冲洗肾脏并储存在冰上，直到机器灌注或移植。最后，用 2-0 丝结扎线结扎肾动脉残端，用 6-0 聚丙烯缝合线闭合腔静脉。该技术可恢复肾脏并模拟活体（单肾）或已故（双肾）供体设置。单肾恢复为进行后续自体移植提供了优势。在已故供体模型中，可以在安乐死前通过将血袋针直接插入主动脉来收集血液，从而使动物放血并为 离体 机器灌注提供血液。

肾移植是终末期肾病 （ESRD） 的最佳治疗方法，与透析相比，可改善生活质量和长期结果¹。尽管器官保存取得了进展，但每天仍有数十人在等待肾移植时死于 ESRD²。机器灌注是一个不断发展的领域，它增加了保存时间，从而扩大了供体网络和更高效的器官分配。该技术还允许体外器官监测和优化，从而最大限度地减少缺血再灌注损伤 （IRI） 的影响。与静态冷库 （SCS） 相比，机器灌注已被证明可显著降低延迟移植物功能的发生率 ^3,4。机器灌注还证明了边缘移植物的活化，否则这些移植物将不符合移植的标准⁵。尽管技术取得了进步，但最常见的保存技术仍然是冰上 SCS。进一步的临床前实验和数据有助于使机器灌注成为肾脏保存的主要方法。

猪肾移植模型已经建立起来，并且一直是保肾技术发展不可或缺的一部分，尤其是机器灌注。与单叶啮齿动物肾脏不同，猪肾和人肾都是多叶的，大小相似，并且具有相似的动脉、静脉和泌尿解剖结构 ^6,7。因此，猪肾有助于直接转化为临床环境，尤其是在医疗器械和药物治疗方面。此外，猪肾显示出与人肾脏相似的 IRI 病理生理学⁸，使其成为肾脏保存研究的理想选择。

为了确保移植物质量和数据可重复性，应遵循标准化和临床可转化的器官和组织获取手术技术。因此，在这里，我们描述了临床前猪模型中肾脏采购的优化方案。该方案允许肾脏恢复并模拟活体（单肾）或已故（双肾）供体设置。单肾恢复具有进行后续自体移植的优势。在双肾恢复模型中，通过将血袋针头直接插入主动脉，可以在安乐死前采集血液，从而使动物放血并为 离体 机器灌注提供血液。

所描述的所有程序均已获得约翰霍普金斯大学机构护理和使用委员会的批准，该委员会是美国农业部 （USDA） 许可、实验动物福利办公室 （OLAW） 保证以及实验动物护理评估和认证协会 （AAALAC） 认可的机构。根据美国农业部的《动物福利法》、美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》以及美国公共卫生服务局的《人道护理和使用实验动物政策》对动物进行饲养。

1. 动物和住房

1. 对于本协议，使用 3-6 个月大的临床健康的 20-40 公斤约克夏猪 （Sus scrofa domesticus） 或类似猪。
2. 将动物安置在铺有板条地板的链式围栏跑道中。

2. 术前作和麻醉

1. 在镇静时间前至少 12 小时让动物禁食。
2. 手术前至少 12 小时口服西甲硅油 （20 mg/kg），并在镇静前至少 1 小时重复给药以减少肠道扩张。
3. 在单个注射器中肌肉注射氯胺酮 （20-30 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （2-3 mg/kg），以避免多次注射。
4. 将猪转移到术前暂存区。在耳边缘静脉放置静脉导管。在整个过程中施用 3-10 mg/kg/h 的 0.9% 生理盐水或乳酸林格氏液。
5. 一旦猪得到充分的镇静，放置一根气管插管（6.0-6.5 毫米带囊气管插管，用于 20-30 公斤动物;6.5-7.0 毫米带囊，用于 30-40 公斤动物）用于气体麻醉和机械通气。如果需要，静脉注射一定剂量的异丙酚 （0.8-1.66 mg/kg），直至有效。
6. 在将动物移入手术室之前，使用剪刀去除手术部位上和周围的毛发，并擦洗手术部位的脏污。
7. 将动物转移到手术台上。手术开始前 10 分钟静脉注射头孢唑啉 （20-22 mg/kg），术中每 90 分钟一次。手术开始时静脉注射泮托拉唑 （0.5-1 mg/kg）。
8. 用利多卡因（高达 2 mg/kg）皮下注射局部阻滞，以促进切口前增加镇痛作用。
9. 无菌准备手术部位，在洗必泰或优碘与 70% 乙醇或生理盐水之间交替使用，至少三次。
10. 持续监测液体容量、心率、血压、脉搏血氧饱和度、二氧化碳图、心电图和直肠温度。每 10-15 分钟记录一次这些值。使用加热的车身底垫和暖风毯以防止体温过低。
11. 在手术开始之前，通过结合下颌张力、睑眼反射和上一步中列出的参数来确认动物在适当的手术麻醉平面内。

3. 采肾程序

1. 按照第 2 节中描述的步骤准备动物进行手术。
2. 在对手术区域进行无菌消毒和悬垂后，进行正中剖腹手术 （25-30 cm） 以获得进入双肾的最佳通路。插入标准腹部牵开器。
3. 用浸泡在温盐水中的毛巾覆盖结肠和小肠。将肠道缩回右侧以进入左肾或向左侧缩回以进入右肾。
4. 打开覆盖在肾脏上的腹膜，解剖肾脏周围以去除任何粘连。解剖输尿管，直到获得 10-12 cm 的长度。
5. 解剖肾静脉和动脉，直到它们分别起源于下腔静脉和主动脉。
6. 完全肾清扫后，用 2-0 丝结扎线将输尿管远端系在输尿管上，并在系带近端切开。保持输尿管近端开放，以便排尿。
7. 用静脉注射肝素 （100 IU/kg） 使动物肝素化并等待 2 分钟以确保肾脏充分肝素化。在切除每个肾脏之前，应重复此步骤。
8. 用两个 Satinsky 血管夹分别夹住靠近主动脉和下腔静脉的肾动脉和肾静脉。通过切开靠近夹子的肾动脉和静脉来移除肾移植物。
9. 立即用 3 mm 钝尖灌注插管插管肾动脉。用冰冷的威斯康星大学 （UW） 溶液或管二醇组氨酸-色氨酸-酮戊二酸 （HTK） 保存溶液冲洗肾脏。
10. 用 UW 或 HTK 冲洗后取出灌注插管，将肾脏放入无菌器官袋中，袋子里装满了用于冲洗肾脏的相同冰冷保存溶液。将此袋子放入第二个无菌器官袋中。随后储存器官或启动机器灌注。
11. 用 2-0 丝结扎线结扎肾动脉残端。用 6-0 聚丙烯的两层连续缝合线闭合肾静脉残端。

4. 采血程序

1. 如果手术是终末手术并且已经进行了所有其他手术干预，请继续采集血液用于机器灌注和放血安乐死。
2. 将肠道缩回右侧并确定肾下腹主动脉。清除覆盖血管的任何大粘连或组织。
3. 将采血袋针头直接插入主动脉。将袋子挂在动物下方以方便填充。一旦袋子装满（大约 450 mL 血液），从主动脉中取出针头并保持对穿刺部位的压力。
4. 对于第二个血袋，将新针头插入前一个穿刺部位近端 1-2 厘米处。根据需要对多个血袋重复，每根针头向近端移动 1-2 厘米。
5. 在收集了所有必要的血液后，静脉注射至少 78 mg/kg 戊巴比妥成分剂量的戊巴比妥钠/苯妥英钠，诱导心脏骤停。如果担心戊巴比妥会干扰随后的肾脏检测，如果氯化钾 （KCl） （75-100 mg/kg IV） 作为替代化学安乐死方法，则在麻醉下对猪给药。通过心跳不足、角膜反射消失和体温显着降低来验证死亡。
   注意：根据 3R 原则，被处死的猪的剩余器官和组织可用于其他研究或教育目的。

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作者没有需要披露的利益冲突。

作者要感谢约翰霍普金斯大学医学院的许多兽医技术人员提供的技术帮助。我们还要感谢 Jessica Izzi 和 Amanda Maxwell 博士，以及众多兽医住院医师，包括 Mallory Brown、Jessica Plunkard 和 Alexis Roach 博士，他们为我们的动物提供了出色的临床护理和兽医监督。最后，我们要感谢约翰霍普金斯大学医学院血管化复合同种异体移植 （VCA） 实验室的所有成员，他们以任何身份协助在我们的实验室进行肾脏获取或其他器官获取程序。这项工作得到了美国国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所 （NIDDK） R44DK136396 资助的支持。