Мышиная модель геморрагической трансформации, индуцированной острой гипергликемией в сочетании с транзиторной фокальной ишемией

В данном исследовании представлен протокол создания высоковоспроизводимой животной модели геморрагической трансформации (ГТ) с использованием окклюзии/реперфузии средней мозговой артерии (MCAO/R) у мышей C57BL/6 с острой гипергликемией.

Геморрагическая трансформация (ГТ) является серьезным осложнением, которое может возникнуть в результате тромболитической терапии после ишемического инсульта (ИИ), и накладывает значительные ограничения на клиническое применение рекомбинантного тканевого активатора плазминогена (ОТ-ПА). К сожалению, в настоящее время в клинической практике не существует эффективных вмешательств по поводу ГТ. Таким образом, существует острая потребность в стабильных и надежных экспериментальных моделях на животных для выяснения патогенеза ГТ и разработки эффективных стратегий вмешательства. В этом исследовании был представлен протокол создания мышиной модели ГТ, индуцированной острой гипергликемией в сочетании с транзиторной фокальной ишемией (тМЦАО). Самцам мышей C57BL/6J вводили 30% глюкозы для индуцирования гипергликемии, а затем подвергали 60 мин tMCAO с реперфузией. Объем инфаркта, целостность гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и степень внутричерепного кровоизлияния оценивали через 24 ч после МКАО. Результаты показали, что введение глюкозы приводило к транзиторной гипергликемии (14,3-20,3 ммоль/л), что значительно увеличивало как объем инфаркта, так и частоту ГТ. Окрашивание гематоксилин-эозином (H&E) указывало на значительные геморрагические поражения в зоне инфаркта у мышей с гипергликемией. Кроме того, у мышей с гипергликемией наблюдалось отягощенное нарушение ГЭБ, о чем свидетельствует более сильная утечка синего Эванса (БЭ) и ФИТК-декстрана. В заключение следует отметить, что острая гипергликемия надежно и последовательно приводила к макроскопической ГТ в мышиной модели tMCAO. Эта воспроизводимая модель предлагает ценный инструмент для исследования патологических механизмов ГТ и разработки соответствующих терапевтических вмешательств.

Инфаркт головного мозга является основной причиной инвалидности и второй по значимости причиной смерти среди взрослого населения во всем мире¹. Острая фаза играет решающую роль в прогрессировании инфаркта головного мозга, служа поворотным моментом для лечения заболевания. Раннее и своевременное восстановление кровотока в области полутени имеет важное значение для предотвращения дальнейшей гибели клеток головного мозга, при этом тромболизис и интервенционная терапия являются основой лечения острого инфаркта головного мозга (ОАС). Тем не менее, геморрагическая трансформация (ГТ) представляет собой значительное осложнение после тромболизиса и интервенционной терапии, возникающее у 15-30% пациентов с ишемическим инсультом, тем самым в некоторой степени ограничивая их применение ^2,3. Возникновение ГТ значительно повышает риск смертности и инвалидности, влияя на прогноз ИАП. Поэтому исследование патологических механизмов ГТ и выявление эффективных терапевтических мишеней имеет большое клиническое значение.

В настоящее время окклюзия средней мозговой артерии (MCAO), индуцированная нитевой эмболией, часто используется в качестве модели ГТ у грызунов⁴. Длительная обструкция может привести к массивному инфаркту головного мозга с вовлечением коры и стриатума, что потенциально может привести к вторичной ГТ. Нитевая МЦАО не требует трепанации черепа, обладает высокой воспроизводимостью и вызывает очаговое повреждение головного мозга и ГТ, подобно инсульту человека. Тем не менее, эта механическая модель имеет некоторые явные недостатки, в том числе высокие показатели ранней смертности и низкие долгосрочные показатели выживаемости⁵. Другой часто используемой моделью ГТ является модель тромболизиса, в которой образование тромба сначала индуцируется в целевом сосуде, а затем используется тромболитические препараты (например, РТ-ПА, варфарин) для растворения тромба, имитируя клинический процесс ГТ при ишемическом инсульте ^6,7. Несмотря на то, что патологический процесс клинической тромболитической терапии в значительной степени воспроизводится, животные модели ГТ, индуцированные ОТ-ПА или варфарином, сложны в реализации и связаны с высокой смертностью животных, а также с различной частотой и локализацией кровотечений. Для продвижения фундаментальных и клинических трансляционных исследований ГТ после инфаркта головного мозга важно создать воспроизводимую животную модель ГТ, которая проста в эксплуатации и обладает высокой стабильностью.

Гипергликемия является значимым фактором развития ГТ после ишемии/реперфузии головного мозга (В/Р)⁸. В нескольких ретроспективных исследованиях были проанализированы клинические данные пациентов, перенесших механическую тромбэктомию, и было выявлено, что повышенный уровень глюкозы в крови при поступлении связан с более высокой частотой спонтанной ГТ³. У пациентов с диабетическим инсультом гипергликемия значительно повышает риск развития ГТ и приводит к более тяжелому неврологическому дефициту ^9,10. Исследователи разработали модели HT, индуцируя церебральный I/R у животных моделей с диабетом с помощью MCAO. Тем не менее, модель диабета-MCAO имеет длительную продолжительность эксперимента, сложную процедуру и высокую стоимость^11,12. Надежная модель ГТ может быть создана путем индуцирования острой гипергликемии путем внутрибрюшинного введения глюкозы и ее интеграции с моделью мозгового I/R, созданной методом наложения швов. Этот метод легко выполняется при постоянном положении кровотечения и эффективно имитирует клинические особенности постинсультной гипергликемии. Тем не менее, существуют значительные различия в критических состояниях, таких как время ишемии и концентрация глюкозы; Кроме того, стабильность модели и частота ГТ не согласуются в различных литературных источниках.

Наша исследовательская группа широко использовала метод острой гипергликемии (MCAO) для создания модели HT. Кроме того, мы провели комплексную серию экспериментов для изучения взаимосвязи между ишемическим временем, концентрацией глюкозы в крови, уровнем заболеваемости ГТ и смертностью животных. Эти эксперименты в конечном итоге привели к выявлению оптимальных условий для создания модели ГТ после инфаркта головного мозга. В этом исследовании представлен подробный протокол для создания модели острой гипергликемии-индуцированной ГТ с использованием внутрибрюшинного введения 30% глюкозы в сочетании с эмболической MCAO.

Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию Цзянханьского университета (JHDXLL2024-080) и проведен в соответствии с Этическими рекомендациями по экспериментальным животным, выпущенными Центром по контролю за заболеваниями Китая. В исследовании использовались взрослые самцы мышей C57BL/6J массой 21–26 г. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Группировка животных и индуцирование острой гипергликемии

1. Разместите мышей в центре лабораторных животных Цзянханьского университета в 12-часовом контролируемом цикле свет/темнота (20–22 °C, влажность 50–55%) с пищей и водой в неограниченном количестве.
2. Случайным образом разделите мышей на четыре группы: Шам + физиологический раствор (n = 12), Шам + глюкоза (n = 12), MCAO + физиологический раствор (n = 12) и MCAO + глюкоза (n = 20).

2. Предоперационная подготовка

Примечание: Все экспериментальные мыши голодали в течение 12 часов перед операцией.

1. Проведение системной анальгезии (мелоксикам, 5 мг/кг подкожно) и местной анестезии в месте разреза (бупивакаин, 2 мг/кг подкожно) периоперационно.
2. Стерилизуйте все хирургические инструменты, ватные палочки и хирургические шовные материалы путем автоклавирования при температуре 121 °C и 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 30 минут.
3. Протрите операционную платформу и окружающую рабочую зону 75% этанолом и включите выключатель обогрева с температурой 37 °C.
4. Обезболите мышь газовой смесью 3% изофлурана и 20% кислорода в индукционной камере анестезии. Затем оцените рефлекс защемления пальца ноги, чтобы проверить глубину анестезии.
5. Переместите мышь на хирургическую платформу в положение лежа и быстро вставьте нос мыши в носовой конус. Откройте поток газа к носовому конусу, перекрыв поток в индукционную камеру анестезии. Отрегулируйте пропорцию изофлурана до 2% и установите расход газовой смеси на 0,4 мл/мин для поддержания анестезии.
6. Нанесите глазной гель на глаза мыши, чтобы сохранить влажность во время операции.
7. Сбрейте шерсть в области шеи с помощью машинки для стрижки животных. Очистите и продезинфицируйте кожу, чередуя нанесение с йодом и 70% этанолом с помощью дезинфицирующей ватной палочки.
8. Накройте шею стерильной марлей и вырежьте отверстие, чтобы обнажить операционную область.

3. Базовое измерение мозгового кровотока

1. Сбрейте волосы в области кожи головы с помощью машинки для стрижки животных. Очистите и продезинфицируйте кожу головы, чередуя нанесение йода и 70% этанола с помощью дезинфицирующей ватной палочки.
2. Сделайте разрез по средней линии длиной 1,0 см на коже над лобной областью, чтобы обнажить черепной родничок. Держите череп влажным с помощью обычного физиологического раствора.
3. Подготовьте инструмент лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) и держите наконечник зонда ЛДФ перпендикулярно поверхности левого теменного черепа (1 мм сзади и 5 мм латерально от брегмы); как только FLUX стабилизируется, и запишите базовое значение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Единицей измерения для FLUX являются перфузионные единицы (PU) с диапазоном измерения от 0 до 1000 PU. Идеальным базовым НБВ на лазерной доплеровской флоуметрии является >600 ПУ. Непрерывный период в 5 секунд с диапазоном колебаний менее 10% считается действительным показанием FLUX.
4. Сшивайте мышцы и кожу отдельно с помощью рассасывающегося шва 5.0 PGA. Нанесите на рану гель диклофенак натрия и мазь мупироцин.

4. Хирургическая процедура MCAO

ПРИМЕЧАНИЕ: MCAO выполняется с использованием модифицированного метода нитевой окклюзии, как ранее было описано Chiang et ^al.13.

1. Осторожно переверните мышь в лежачее положение и введите мышам внутрибрюшинно 30% глюкозы (7,2 мл/кг) или физиологический раствор за 15 минут до хирургической процедуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши из групп Sham + glucose и MCAO + glucose получали внутрибрюшинные инъекции глюкозы. Мыши из групп Шам + физраствор и MCAO + солевой раствор получали внутрибрюшинные инъекции обычного физиологического раствора.
2. Сбрейте шерсть в области шеи с помощью машинки для стрижки животных. Очистите и продезинфицируйте кожу, чередуя нанесение с йодом и 70% этанолом с помощью дезинфицирующей ватной палочки. Накройте шею стерильной марлей и вырежьте отверстие, чтобы обнажить операционную область.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что разрез остается прямым, чтобы добиться оптимальной визуализации сонной артерии.
3. Сделайте разрез по средней линии размером 1,5 см на вентральной стороне шеи с помощью скальпеля. Раздвиньте подкожную клетчатку и поверхностную фасцию с помощью хирургического пинцета.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что разрез остается прямым, чтобы добиться оптимальной визуализации сонной артерии.
4. Под поверхностной фасцией расположите подчелюстную железу и перевернутый треугольник, образованный тремя мышцами: грудиноягодиной, расположенной по средней линии над трахеей; заднее брюшко двужелудочной мышцы, узнаваемое по блестящей белой сухожильной части; и, наконец, грудино-сосцевидная мышца.
5. Выполните тупое рассечение в пределах перевернутого треугольника, чтобы определить и отделить левую общую сонную артерию (ОСА).
6. Рассеките блуждающий нерв, прилегающий к ОЦА, и слизистую ткань, окружающую кровеносные сосуды, с помощью офтальмологических щипцов. Сделайте рингер на CCA с помощью рассасывающегося шовного материала 5,0 полигликолевой кислоты (PGA), но держите шов ненатянутым.
7. При выделении вверх по ОСА можно наблюдать разветвление «Y», разделяющее ОСА на наружную сонную артерию (ЭКА) и внутреннюю сонную артерию (ВСА).
8. Отделите бифуркацию, чтобы полностью обнажить ECA и ICA. Зафиксируйте и плотно завяжите рассасывающийся шов 5.0 PGA вокруг ECA дистально от разветвления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте достаточное расстояние между местом постоянной перевязки и разветвлением сосудов, чтобы предотвратить смещение нити во время вращения ЭХА.
9. Временно зажмите ОСА и ВСА с помощью двух легких микросеррафинных артериальных зажимов размером 8 мм x 2 мм, чтобы перекрыть кровоток от ОСА к ВСА.
10. Растяните завязку шва на дистальном отделе ЭХА и ОСА, чтобы выпрямить сегмент ЭХА.
11. С помощью микроножниц сделайте небольшой разрез между двумя шовными завязками на ECA.
12. Вставьте монофиламентный шовный материал с силиконовым покрытием (длиной 30 мм, силиконовым покрытием 3–4 мм) в ECA. Зафиксируйте и слегка завяжите второй рассасывающийся шовный материал 5.0 PGA на ECA рядом с разветвлением, чтобы предотвратить отступление монофиламентного шва.
13. Полностью разрежьте ЭХА дистальнее постоянной лигации и снимите зажим артериальных щипцов с ВСА.
14. Отведите шов до разветвления ОСА, затем аккуратно втяните и поверните культю ЭКА. Отрегулируйте направление введения шовной нити и медленно вводите ее, примерно на 9,0–10,0 мм от разветвления CCA в ICA, чтобы окклюзировать MCA.
15. Затяните второй рассасывающийся шов PGA вокруг ECA и снимите артериальный зажим с CCA.
16. Сшивайте мышцы и кожу отдельно с помощью рассасывающегося шва 5.0 PGA. Нанесите на рану гель диклофенак натрия и мазь мупироцин.
17. Аккуратно переверните мышь в положение лежа и повторите шаг 3.4. для записи кровотока после окклюзии MCA.
    Мыши, у которых наблюдалось снижение кровотока менее чем на 40% от исходного значения после MCAO, были исключены из исследования¹⁴.
18. Включите выключатель обогрева каркаса восстановления с температурой 37°C. Поместите мышь в клетку для восстановления в период после окклюзии (60 минут).

5. Удаление и реперфузия моноволокна

1. Повторно обезболите мышь, как описано ранее, непосредственно перед окончанием периода окклюзии.
2. Зажмите CCA с помощью артерного зажима microclip.
3. Частично втяните мононить из ICA до тех пор, пока наконечник с силиконовым покрытием не станет виден через ICA.
4. Поместите еще один зажим артерии с микрозажимом на ВСА над наконечником с силиконовым покрытием.
5. Полностью извлеките монофиль и плотно зажмите пень ЭХА.
6. Снимите артерный зажим микроклипсы с ВСА и ОСА соответственно.
7. Сшивайте мышцы и кожу слой за слоем с помощью рассасывающегося шовного материала 5.0 PGA.
8. Поместите мышь в камеру восстановления и наблюдайте за всеми мышами, пока они полностью не придут в себя. Применяйте мелоксикам (5 мг/кг, подкожно) для облегчения боли каждые 12 ч в течение 24 ч.

6. Измерение уровня глюкозы в крови

Примечание: Уровень глюкозы в крови измеряли в следующие временные моменты: (1) непосредственно перед операцией MCAO (исходный уровень), (2) сразу после введения моноволокна (через 15 минут после введения глюкозы), (3) сразу после удаления моноволокна сразу после введения моноволокна (через 75 минут после введения глюкозы).

1. Протрите хвост мыши спиртовым ватным тампоном, чтобы сделать жилу на хвосте полностью гиперемичной.
2. Отрежьте кончик хвоста на 1–2 мм с помощью хирургических ножниц.
3. Аккуратно сожмите вдоль корня хвоста до кончика хвоста, способствуя оттоку крови из разреза.
4. Расположите резервуар для абсорбции образца тестовой бумаги на краю капли крови.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь будет втянута в тестовую бумагу из-за эффекта сифона.
5. Считайте показания глюкометра и запишите результат.
   Примечание: Исключите мышей, у которых уровень глюкозы в крови не поднимался выше 10 ммоль/л после 15 минут инъекции глюкозы.
6. Удалите излишки крови с помощью ватного тампона и надавите, чтобы остановить кровотечение.

7. Окрашивание 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТХ)

1. Усыпите мышь путем внутрибрюшинного введения передозировки пентобарбитала (300 мг/кг).
2. Как только мышь перестанет дышать, немедленно обездвижьте ее в положении лежа на спине.
3. Вскройте грудную клетку с помощью ножниц, и вырежьте диафрагму, чтобы обнажить сердце.
4. Введите инъекционную иглу 23 G в левый желудочек мыши и разрежьте ножницами ушной аппендикс.
5. Принимайте 15 мл физиологического раствора до тех пор, пока жидкость, вытекающая из ушного аппендикса, не станет чистой и прозрачной.
6. Обезглавите мышь и разрежьте скальп с помощью ножниц, чтобы полностью обнажить череп. Вставьте кончик ножниц на 2 мм немного впереди коронкового шва черепа, чтобы поддеть его.
7. С помощью пинцета удалите неповрежденную мозговую ткань мыши.
8. Поместите мозговую ткань в матрицу мозга грызуна и разрежьте ее на корональные срезы диаметром 2 мм.
9. Переложите ломтики в 24-луночный планшет и инкубируйте их с 2% раствором TTC при 37 °C в течение 15 минут.
10. Запустите программное обеспечение для сканирования и установите для параметра разрешение 1200 dpi и формат JPG для анализа изображений.
11. Отрежьте срезы ткани от 24-луночного планшета изогнутыми щипцами и расположите срезы на стеклянной сканирующей пластине.
12. Отсканируйте срезы тканей, а затем экспортируйте изображения для анализа измерений.
13. Измерьте площадь инфаркта, скорректировав отек тканей. Вычесть неинфарктную область ипсилатеральной стороны из площади контралатеральной стороны с помощью программного обеспечения ImageJ¹⁵. Оценивайте размер инфаркта в процентах от контралатерального полушария. Для получения дополнительной информации об анализе площади инфаркта см. Friedländer et ^al.16.

8. НаблюдениеГросса

1. Повторите шаги 7.1–7.8.
2. Вырежьте срезы ткани из матрисы мозга изогнутыми щипцами и расположите срезы на стеклянной сканирующей пластине.
3. Отсканируйте корональные срезы головного мозга, как описано в шагах 7.10 и 7.12.

9. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

1. Повторите шаги 7.1–7.4. Медленно перфузируйте 15 мл нормального физиологического раствора с последующей перфузией примерно 15 мл параформальдегида (PFA).
2. Повторите шаги 7.6–7.7. Зафиксируйте мозговую ткань 4% PFA на 24 ч при комнатной температуре.
3. Поместите неподвижную ткань мозга в автоматический дегидратор тканей для обезвоживания, витрификации и погружения в воск.
4. Погрузите ткань в парафин и разрежьте ткань мозга на корональные срезы толщиной 5 мкм с помощью микротома.
5. Очистите ломтик от воска, погрузив его в ксилол три раза, каждое погружение длится 8 минут. Затем постепенно погружайте срез в растворы этанола с убывающей концентрацией (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), а затем дистиллированную воду, причем каждый этап длится 5 минут.
6. Срез окрасить раствором гематоксилина на 3 мин. Затем дифференцируйте его, погрузив в 5% спирт соляной кислоты на 5 секунд.
7. Инкубируйте срез с раствором эозина в течение 1 минуты, затем обезвожьте и гиалинизируйте его градиентным раствором этанола (90%, 95%, 100%) и ксилолом.
8. Смонтируйте секцию с помощью нейтральных смол.
9. Получите изображения окрашенных H&E срезов мозга под ярким полем с помощью флуоресцентной микроскопии.

10. Определение лекаге Эванс Блю (EB)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об этой процедуре, пожалуйста, обратитесь к Wang et ^al.17.

1. Введите 2% (w/v) раствор Evans Blue (EB) (2 мл/кг) через хвостовую вену через 23 ч после MCAO.
2. Повторите шаги 7.1–7.7 через час после инъекции БЭ и сделайте фотографию всего мозга.
3. Поместите мозг в мозговую матрицу грызуна и разрежьте его коронально на ломтики диаметром 2 мм. Отсканируйте корональные срезы головного мозга, как описано в шагах 7.10–7.12, чтобы выявить утечку БЭ.
4. Разделите ломтики на правую и левую части и положите каждый в центрифужную пробирку.
5. Гомогенизируйте каждый срез мозговой ткани в 50% трихлоруксусной кислоте, в соотношении 100 мг мозговой ткани к 0,4 мл трихлоруксусной кислоты.
6. После инкубации при 4 °C в течение ночи гомогенат центрифугирует в течение 30 минут при 10 000 x g (при 4 °C).
7. Переложите надосадочную жидкость в другую центрифужную пробирку и разбавьте ее этанолом в четыре раза.
8. Измерьте поглощение надосадочной жидкости на длине волны 620 нм с помощью спектрофотометра.
9. Преобразуйте значения поглощения в концентрацию EB с помощью стандартной кривой EB в этаноле (например, при 31,25, 62,5, 125 и 250 мкг/мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Результат представлен в виде микрограмма EB на грамм мозговой ткани.

11. Определение утечки FITC-Dextran

1. Введите FITC-декстран (10 кДа, 6 мг/мл, разведенный в 0,01M PBS; 4 мл/кг) в хвостовую вену через 24 ч после MCAO, позволяя ему циркулировать в крови в течение 10 минут.
2. Повторите шаги 7.1–7.7, чтобы выполнить перфузию и удалить неповрежденную ткань мозга.
3. Зафиксируйте мозговую ткань в 4% PFA на 24 часа при комнатной температуре в темноте.
4. Перенесите неподвижную мозговую ткань в раствор сахарозы с градиентными концентрациями 10%, 20% и 30% (разведенный в 0,01М PBS) для обезвоживания.
5. Внедрите мозговую ткань с помощью компаунда оптимальной температуры резки (ОКТ) и разрежьте на участки мозговой ткани толщиной 30 мкм. Перенесите срезы на предметное стекло микроскопа с помощью петли для инокуляции и убедитесь, что они прилипают к поверхности предметного стекла.
6. Смонтируйте срезы ткани мозга с помощью монтажной среды, содержащей 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI).
7. Запустите лазерную конфокальную микроскопию и управляющее программное обеспечение.
8. Закрепите предметное стекло микроскопа на предметном столике и найдите область инфаркта под 200-кратным окуляром.
9. Установите разрешение на 1024 x 1024 и отрегулируйте значение усиления и время экспозиции, чтобы получить максимально четкое изображение.
10. Получение изображений окрашенной области инфаркта головного мозга FITC-Dextran с длиной волны возбуждения 488 нм.

Экспериментальная методика данного исследования проиллюстрирована на рисунке 1. В течение 60 мин мышам проводили индуцированную окклюзией нитью MCAO с последующей реперфузией. Глюкозу (30% в нормальном физиологическом растворе, 7,2 мл/кг массы те?...

Настоящий протокол разработан для создания надежной животной модели геморрагической трансформации после ишемического инсульта, которая может воспроизводить вредные эффекты реваскуляризации сосудов в условиях гипергликемии. Среди различных факторов риска ишемич?...

У авторов нет противоречащих друг другу интересов, которые можно было бы раскрыть.

Рисунок 1 был создан с помощью программного обеспечения BioRender (https://www.biorender.com/). Это исследование было поддержано грантами руководящего проекта Фонда естественных наук провинции Хубэй (No 2022CFC057).

This corrects the article 10.3791/67371