一過性限局性虚血と組み合わせた急性高血糖によって誘発される出血性形質転換のマウスモデル

この研究は、急性高血糖のC57BL/6マウスにおける中大脳動脈閉塞/再灌流(MCAO/R)を使用した出血性形質転換(HT)の再現性の高い動物モデルを確立するためのプロトコルを提示します。

出血性形質転換 (HT) は、虚血性脳卒中 (IS) 後の血栓溶解療法の結果として発生する可能性のある重篤な合併症であり、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子 (rt-PA) の臨床応用に大きな制限をもたらします。残念ながら、現在、臨床診療でHTに利用できる効果的な介入はありません。そのため、HTの病因を解明し、効果的な介入戦略を開発するためには、安定的で信頼性の高い実験動物モデルが急務となっています。この研究では、一過性局所性虚血と組み合わせた急性高血糖症(tMCAO)によって誘発されるHTのマウスモデルを確立するためのプロトコルを提示しました。雄のC57BL/6Jマウスに30%グルコースを注射して高血糖を誘導した後、再灌流を伴う60分間のtMCAOを行った。梗塞の体積、血液脳関門 (BBB) の完全性、および頭蓋内出血の程度は、MCAO の 24 時間後に評価されました。その結果、グルコース注射により一過性の高血糖(14.3-20.3 mmol/L)が引き起こされ、梗塞容積とHTの発生率が有意に増加したことが示されました。さらに、高血糖マウスは、エバンスブルー(EB)とFITC-デキストランのより深刻な漏出によって示されるように、悪化したBBB破壊を示しました。結論として、急性高血糖は、tMCAOのマウスモデルにおいて、信頼性的かつ一貫して巨視的HTをもたらしました。この再現可能なモデルは、HTの病理学的メカニズムを調査し、対応する治療介入を開発するための貴重なツールを提供します。

脳梗塞は、障害の主な原因であり、世界中の成人の死因の第2位です¹。急性期は、脳梗塞の進行に重要な役割を果たし、疾患治療の要点となります。脳細胞のさらなる死を防ぐためには、半影領域の血流を早期かつ早期に回復させることが不可欠であり、血栓溶解療法とインターベンション療法は急性脳梗塞(ACI)治療の主力です。しかし、出血性形質転換 (HT) は、血栓溶解および介入療法後に重大な合併症を引き起こし、虚血性脳卒中の患者の 15% から 30% に発生するため、その適用はある程度制限されます ^2,3。HTの発生は、死亡および障害のリスクを著しく増加させ、ACIの予後に影響を及ぼします。したがって、HTの病理学的メカニズムを調査し、有効な治療標的を特定することは、臨床的に非常に重要です。

現在、糸塞栓症による中大脳動脈閉塞症(MCAO)は、げっ歯類のHTのモデルとして頻繁に利用されています⁴。閉塞が長引くと、皮質と線条体が関与する大規模な脳梗塞を引き起こす可能性があり、二次的なHTにつながる可能性があります。ただし、この機械的モデルには、早期死亡率が高く、長期生存率が低いなど、いくつかの明確な欠点があります⁵。また、よく使われるHTモデルは血栓溶解モデルで、まず標的血管に血栓形成が誘導され、続いて血栓溶解薬(rt-PA、ワルファリンなど)を用いて血栓を溶解し、虚^血性脳卒中におけるHTの臨床過程を模倣しています^6,7。臨床血栓溶解療法の病理学的プロセスを大幅に再現しているにもかかわらず、rt-PAまたはワルファリンによって誘導されるHT動物モデルは、実装が複雑であり、高い動物死亡率、および出血の発生率と場所の変動に関連しています。脳梗塞後のHTに関する基礎的および臨床的トランスレーショナルリサーチを進めるためには、操作が容易で安定性の高い再現可能なHT動物モデルを確立することが不可欠です。

高血糖は、脳虚血/再灌流 (I/^{R) 後の} HT に大きく寄与します8。いくつかのレトロスペクティブ研究により、機械的血栓摘出術を受けている患者の臨床データが分析され、入院時の血糖値の上昇が自然発生的な^HT3の発生率が高いことに関連していることが明らかになりました。糖尿病性脳卒中患者では、高血糖はHTのリスクを著しく増加させ、より深刻な神経学的欠損につながります^9,10。研究者らは、MCAOを通じて糖尿病動物モデルに脳I/Rを誘導することにより、HTモデルを開発しました。ただし、糖尿病-MCAOモデルは、実験期間が長く、手順が複雑で、コストが高い^11,12。グルコースの腹腔内注射により急性高血糖を誘発し、縫合技術によって生成された脳I/Rモデルと統合することで、HTの信頼性の高いモデルを確立できます。この方法は、一貫した出血位置で簡単に実行でき、脳卒中後の高血糖の臨床的特徴を効果的に模倣します。ただし、虚血時間やグルコース濃度などの重要な条件には大きな違いがあります。さらに、モデルの安定性とHTの発生率は、異なる文献で一貫性がありません。

私たちの研究グループでは、急性高血糖-MCAO法を広く活用してHTモデルを確立しました。さらに、虚血時間、血糖値、HT発生率、および動物の死亡率との関係を調査するために、包括的な一連の実験を実施しました。これらの実験は、最終的に脳梗塞後のHTモデルを作成するための最適な条件を特定することにつながりました。この研究は、塞栓性MCAOと組み合わせた30%グルコースの腹腔内注射を使用して、急性高血糖誘発性HTモデルを確立するための詳細なプロトコルを提示します。

この実験プロトコルは、江漢大学の動物施設管理委員会(JHDXLL2024-080)によって承認され、中国疾病管理センターが発行した実験動物倫理ガイドラインに従って実施されました。この研究では、体重21〜26 gの成体雄C57BL/6Jマウスを使用しました。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1.動物のグループ化と急性高血糖の誘発

1. 江漢大学の実験動物センターで、12時間の明暗サイクル制御環境(20〜22°C、湿度50%〜55%)でマウスを飼育し、餌と水 を自由に 使用します。
2. マウスを無作為に4つのグループに分けます:偽+生理食塩水(n = 12)、偽+グルコース(n = 12)、MCAO +生理食塩水(n = 12)、およびMCAO +グルコース(n = 20)。

2. 術前準備

注:すべての実験マウスは、手術前に12時間絶食しました。

1. 全身性鎮痛剤(メロキシカム、5 mg / kg皮下)と局所麻酔を切開部位(ブピバカイン、2 mg / kg皮下)に周術期に投与します。.
2. すべての手術器具、綿棒、および外科用縫合糸を、121°Cおよび15psiの条件で30分間オートクレーブすることにより滅菌します。
3. 手術台と周囲の作業エリアを75%エタノールで拭き、温度を37°Cに設定して暖房スイッチを入れます。
4. 麻酔導入チャンバー内で3%イソフルラン-20%酸素ガス混合物でマウスを麻酔します。次に、つま先のつま先つまみ反射を評価して、麻酔の深さをテストします。
5. 手術台上のマウスを腹臥位で動かし、マウスの鼻をノーズコーンにすばやく挿入します。ノーズコーンへのガスの流れを開き、麻酔誘導チャンバーへの流れを遮断します。イソフルランの割合を2%に調整し、ガス混合物の流量を0.4mL / minに設定して麻酔を維持します。.
6. マウスの目にアイジェルを塗布して、手術中の水分を保ちます。
7. 動物のバリカンを使用して首の部分の毛を剃ります。ヨウ素と70%エタノールを交互に塗布し、消毒剤のコットンスティックを使用して皮膚を洗浄および消毒します。
8. 首に滅菌ガーゼを覆い、手術領域を露出させるために開口部を開けます。

3. ベースライン時の脳血流測定

1. 動物用バリカンを使用して頭皮の部分の髪を剃ります。ヨウ素と70%エタノールを交互に塗布し、消毒剤の綿棒を使用して頭皮をきれいにし、消毒します。
2. 頭蓋泉門を露出させるために、前頭領域の上の皮膚に長さ1.0cmの正中線切開を行います。頭蓋骨を通常の生理食塩水で湿らせておきます。
3. レーザードップラーフローメトリー(LDF)機器を準備し、LDFプローブの先端を左頭頂頭蓋骨の表面に対して垂直に保持します(ブレグマの後方1 mmと横5 mm)。FLUXが安定したら、ベースライン値を記録します。
   注:FLUXの測定単位は灌流ユニット(PU)で、測定範囲は0〜1000PUです。レーザードップラーフローメトリーの理想的なベースラインCBFは>600PUです。変動範囲が 10% 未満の 5 秒間の連続は、有効な FLUX 読み取り値と見なされます。
4. 5.0 PGA吸収性縫合糸を使用して、筋肉と皮膚を別々に縫合します。ジクロフェナクナトリウムゲルとムピロシン軟膏を創傷に塗布します。

4. MCAOの外科的処置

注:MCAOは、Chiangらによって以前に説明されたように、修正されたスレッドオクルージョン法を使用して実行されます¹³。

1. マウスを静かに仰臥位に戻し、外科的処置の15分前にマウスに腹腔内30%グルコース(7.2 mL / kg)または生理食塩水を投与します。.
   注:Sham +グルコースおよびMCAO +グルコースグループのマウスは、グルコースの腹腔内注射を受けました。シャム+生理食塩水群およびMCAO+生理食塩水群のマウスは、生理食塩水の腹腔内注射を受けた。
2. 動物のバリカンを使用して首の部分の髪を剃ります。ヨウ素と70%エタノールを交互に塗布し、消毒剤のコットンスティックを使用して皮膚を洗浄および消毒します。首に滅菌ガーゼを覆い、手術領域を露出させるために開口部を開けます。
   注:頸動脈の最適な視覚化を達成するために、切開部がまっすぐに保たれていることを確認してください。
3. メスを使用して、首の腹側に1.5cmの正中線を切開します。外科用ピンセットを使用して、皮下組織と表在性筋膜を引き離します。
   注:頸動脈の最適な視覚化を達成するために、切開部がまっすぐに保たれていることを確認してください。
4. 表在筋膜の下に、顎下腺と3つの筋肉によって形成された逆三角形を見つけます:気管の正中線に位置する胸骨舌骨。二腹部筋の後腹は、光沢のある白い腱の部分で認識できます。そして最後に、胸骨乳様突起筋です。
5. 逆三角形内で鈍的解剖を行い、左総頸動脈(CCA)を特定して分離します。
6. CCAに隣接する迷走神経と血管の周囲の粘膜組織を眼鉗子で解剖します。5.0ポリグリコール酸(PGA)吸収性縫合糸を使用してCCAにリンガーを作成しますが、縫合糸に張力がかからないようにしてください。
7. CCAに沿って上方に分離すると、「Y」字の分岐部が観察され、CCAが外部頸動脈(ECA)と内部頸動脈(ICA)に分割されます。
8. 分岐部を分離して、ECAとICAを完全に露出させます。5.0 PGA吸収性縫合糸をECAの分岐部から遠位にループしてしっかりと結びます。
   注:ECAの回転中に糸が外れるのを防ぐために、永久結紮部位と血管分岐部との間に十分な距離を確保してください。
9. 8 mm x 2 mm の軽量マイクロセラファイン動脈クランプ 2 つを使用して CCA と ICA の両方を一時的にクランプし、CCA から ICA への血流を遮断します。
10. ECA遠位部とCCAの縫合タイを伸ばして、ECAセグメントをまっすぐにします。
11. マイクロハサミを使用して、ECAの2つの縫合タイの間に小さな切開を行います。
12. シリコンコーティングされたモノフィラメント縫合糸(長さ30 mm、コーティングされたシリコン3〜4 mm)をECAに挿入します。モノフィラメント縫合糸が後退するのを防ぐために、分岐部近くのECAに2番目の5.0 PGA吸収性縫合糸をループしてわずかに結びます。
13. 永久結紮の遠位ECAを完全に切断し、動脈鉗子クランプをICAから取り外します。
14. 縫合糸をCCAの分岐部まで引き抜き、ECAの切り株を慎重に引っ込めて回転させます。縫合糸の挿入方向を調整し、CCA分岐部からICAに約9.0〜10.0mmゆっくりと挿入して、MCAを閉塞します。
15. ECAの周りの2番目のPGA吸収性縫合糸を締め、動脈クランプをCCAから取り外します。
16. 5.0 PGA吸収性縫合糸を使用して、筋肉と皮膚を別々に縫合します。ジクロフェナクナトリウムゲルとムピロシン軟膏を創傷に塗布します。
17. マウスを静かに腹臥位に戻し、手順3.4を繰り返します。MCA閉塞後の血流を記録します。
    注: MCAO 後のベースライン値の 40% 未満の血流減少を示すマウスは、研究から除外されました¹⁴。
18. 温度を37°Cに設定して、リカバリーケージの加熱スイッチをオンにします。 閉塞後(60分)にマウスをリカバリーケージに入れます。

5.モノフィラメントの除去と再灌流

1. 閉塞期間が終了する直前に、前に説明したようにマウスを再麻酔します。
2. マイクロクリップ動脈クランプを使用してCCAをクランプします。
3. シリコンコーティングされた先端がICAを通して見えるようになるまで、モノフィラメントをICAから部分的に引っ込めます。
4. 別のマイクロクリップ動脈clを配置しますampシリコンコーティングされた先端の上のICAに。
5. モノフィラメントを完全に引き抜き、ECAの切り株をしっかりと結紮します。
6. マイクロクリップ動脈クランプをICAとCCAからそれぞれ取り外します。
7. 5.0 PGA吸収性縫合糸を使用して、筋肉と皮膚を層ごとに縫合します。
8. マウスを回復チャンバーに入れ、すべてのマウスが完全に目覚めるまで監視します。痛みを和らげるためにメロキシカム(5 mg / kg、皮下)を最大24時間12時間投与します。.

6. 血糖値測定

注: 血糖値は、(1) MCAO 手術の直前 (ベースライン)、(2) モノフィラメント挿入直後 (グルコース注射の 15 分後)、(3) モノフィラメントの抜去直後 モノフィラメント挿入直後 (グルコース注射の 75 分後) で測定されました。

1. マウスの尻尾をアルコール性のコットンボールで拭き、尻尾の静脈を完全に充血させます。
2. 手術用ハサミを使用して尾の先端を1〜2mm切り取ります。
3. 尾の付け根に沿って尾の先端までそっと絞って、切開部から血液が流れ出すのを促進します。
4. 試験紙のサンプル吸収タンクを血滴の端に配置します。
   注:吸い上げ効果により、血液が試験紙に引き込まれます。
5. 血糖値計の読み取り値を読み取り、結果を記録します。
   注:グルコース注射の15分後に血糖値が10 mmol / Lを超えなかったマウスは除外します。.
6. 綿球で余分な血液を取り除き、圧力をかけて出血を止めます。

7. 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色

1. ペントバルビタール(300 mg / kg)の過剰投与の腹腔内注射によりマウスを安楽死させます。.
2. マウスの呼吸が止まったら、すぐに仰臥位で固定します。
3. ハサミで胸部を開き、横隔膜を切り取って心臓を露出させます。
4. マウスの左心室に23Gの注射針を挿入し、ハサミで耳介を切開します。
5. 耳介虫垂から排出される液体が透明で透明になるまで、15 mLの生理食塩水を灌流します。.
6. ネズミの首を切り落とし、ハサミで頭皮を切り開いて頭蓋骨を完全に露出させます。ハサミの先端を頭蓋骨の冠状縫合糸の少し前に2mm挿入して、頭蓋骨をこじ開けます。
7. ピンセットを使用して、マウスの脳組織を無傷で取り除きます。
8. げっ歯類の脳マトリックスに脳組織を入れ、2mmの冠状スライスに切ります。
9. スライスを24ウェルプレートに移し、2% TTC溶液と37°Cで15分間インキュベートします。
10. スキャンソフトウェアを起動し、パラメータ設定を1200dpiの解像度と画像分析用のJPG形式に設定します。
11. 湾曲した鉗子で24ウェルプレートから組織切片を切り取り、切片をガラススキャンプレートに配置します。
12. 組織切片をスキャンし、測定分析のために画像をエクスポートします。
13. 組織の腫れを補正することにより、梗塞領域を測定します。ImageJソフトウェア¹⁵を使用して、反対側の領域から同側側の非梗塞領域を差し引きます。梗塞のサイズを対側半球のパーセンテージとして評価します。梗塞領域分析の詳細については、Friedländer et ^al.16を参照してください。

8.Gロス観測

1. 手順7.1〜7.8を繰り返します。
2. 湾曲した鉗子で脳マトリックスから組織切片を切り取り、ガラススキャンプレート上に切片を配置します。
3. ステップ7.10および7.12で説明されているように、脳冠状切片をスキャンします。

9. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色

1. 手順7.1〜7.4を繰り返します。15 mLの生理食塩水をゆっくりと灌流し、続いて約15 mLのパラホルムアルデヒド(PFA)を灌流します。
2. 手順7.6〜7.7を繰り返します。脳組織を4%PFAで室温で24時間固定します。
3. 固定された脳組織を自動組織脱水機に入れ、脱水、ガラス化、ワックス浸漬を行います。
4. 組織をパラフィンワックスに埋め込み、ミクロトームにより脳組織を厚さ5μmの冠状切片に切断します。
5. スライスをキシレンに3回浸して脱ろうし、各浸漬は8分間続きます。次に、スライスを濃度が減少するエタノール溶液(100%、95%、90%、80%、70%)に徐々に浸し、続いて蒸留水に浸し、各ステップを5分間持続させます。
6. スライスをヘマトキシリン溶液で3分間染色します。次に、5%塩酸アルコールに5秒間浸漬して区別します。
7. スライスをエオシン溶液で1分間インキュベートし、次いでグラジエントエタノール溶液(90%、95%、100%)およびキシレンで脱水およびヒアリン化する。
8. 中性樹脂でセクションを取り付けます。
9. 蛍光顕微鏡を使用して、明視野下でH&Eで染色された脳スライスの画像をキャプチャします。

10. エバンスブルー(EB)レカゲの決定

注:この手順の詳細については、Wang et ^al.17を参照してください。

1. MCAOの23時間後に尾静脈 を介して 2%(w / v)エバンスブルー(EB)溶液(2 mL / kg)を注入します。.
2. EB注射の1時間後に手順7.1〜7.7を繰り返し、脳全体の写真を撮影します。
3. 脳をげっ歯類の脳マトリックスに入れ、冠状に2mmのスライスに切ります。ステップ7.10〜7.12で説明したように脳冠状切片をスキャンして、EB漏出を観察します。
4. スライスを左右に分け、それぞれを遠心分離管に入れます。
5. 脳組織のすべてのスライスを50%トリクロロ酢酸でホモジナイズし、脳組織100 mgとトリクロロ酢酸0.4 mLの比率でホモジナイズします。
6. 4°Cで一晩インキュベートした後、ホモジネートを10,000 x g (4°C)で30分間遠心分離します。
7. 上清液を別の遠心分離チューブに移し、エタノールで4倍に希釈します。
8. 分光光度計を使用して、620nmで上澄み液の吸光度を測定します。
9. エタノール中のEBの標準曲線(例:31.25、62.5、125、250 ug/mL)を使用して、吸光度値をEBの濃度に変換します。
   注:結果は、脳組織のグラムあたりEBのマイクログラムとして表されます。

11. FITC-デキストラン漏洩の判定

1. MCAOの24時間後にFITC-デキストラン(10 KDa、6 mg / mL、0.01M PBSで希釈、4 mL / kg)を尾静脈に注入し、血液中を10分間循環させます。.
2. 手順7.1〜7.7を繰り返して灌流を行い、無傷の脳組織を切除します。
3. 暗闇の中で室温で脳組織を4%PFAに24時間固定します。
4. 固定した脳組織を、10%、20%、30%の勾配濃度(0.01M PBSで希釈)のショ糖溶液に移し、脱水を行います。
5. 最適な切断温度化合物(OCT)を使用して脳組織を埋め込み、厚さ30μmの脳組織切片に切断します。接種ループを使用して切片を顕微鏡スライドに移し、スライドの表面に付着していることを確認します。
6. 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む封入剤を使用して、脳組織切片をマウントします。
7. レーザー共焦点顕微鏡とその制御ソフトウェアを起動します。
8. 顕微鏡のスライドをオブジェクトステージに固定し、200倍接眼レンズの下に梗塞領域を配置します。
9. 解像度を1024 x 1024に設定し、ゲイン値と露光時間を調整して、可能な限り鮮明な画像を取得します。
10. 脳梗塞のFITC-Dextran染色領域を488nmの励起波長で画像を取得します。

この研究の実験手順を図1に示します。簡単に説明すると、マウスは糸閉塞誘発性MCAOを60分間受け、続いて再灌流されました。グルコース(生理食塩水で30%、体重7.2 mL / kg)をMCAOの15分前に腹腔内投与しました。.血糖値は、ベースライン時(グルコース注射前)、MCAO直後、および再灌流時に測定されました。24時間の再灌流後、マウスを?...

現在のプロトコルは、虚血性脳卒中後の出血性形質転換の信頼性の高い動物モデルを作成するように設計されており、高血糖条件下での血管血行再建術の有害な影響を再現できます。虚血性脳卒中のさまざまな危険因子の中で、脳卒中発症後24時間以内の血糖値は、脳損傷の悪化および死亡率の増加と正の相関があります^3,18

著者らには、開示すべき対立する利益はありません。

図1はBioRenderソフトウェア(https://www.biorender.com/)で作成しました。本研究は、湖北省自然科学基金会の指導プロジェクト(No.2022CFC057)の助成を受けて行われました。

This corrects the article 10.3791/67371