JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لإنشاء نموذج حيواني قابل للتكرار بدرجة عالية للتحول النزفي (HT) باستخدام انسداد / إعادة ضخ الشريان الدماغي الأوسط (MCAO / R) في الفئران C57BL / 6 المصابة بارتفاع السكر في الدم الحاد.

Abstract

التحول النزفي (HT) هو أحد المضاعفات الخطيرة التي يمكن أن تحدث نتيجة للعلاج الانحلال للتخثر بعد السكتة الدماغية الإقفارية (IS) ، وتشكل قيودا كبيرة على التطبيق السريري لمنشط البلازمينوجين للأنسجة المؤتلفة (rt-PA). لسوء الحظ ، لا توجد حاليا تدخلات فعالة متاحة ل HT في الممارسة السريرية. لذلك ، هناك حاجة ملحة لنماذج حيوانية تجريبية مستقرة وموثوقة لتوضيح التسبب في HT وتطوير استراتيجيات تدخل فعالة. قدمت هذه الدراسة بروتوكولا لإنشاء نموذج فأر ل HT الناجم عن ارتفاع السكر في الدم الحاد جنبا إلى جنب مع نقص التروية البؤري العابر (tMCAO). تم حقن ذكور الفئران C57BL / 6J بنسبة 30٪ جلوكوز للحث على ارتفاع السكر في الدم ثم تعرضت ل 60 دقيقة من tMCAO مع إعادة التروية. تم تقييم حجم الاحتشاء وسلامة الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ودرجة النزيف داخل الجمجمة بعد 24 ساعة من MCAO. أظهرت النتائج أن حقن الجلوكوز أدى إلى ارتفاع السكر في الدم العابر (14.3-20.3 مليمول / لتر) ، مما أدى إلى زيادة كبيرة في كل من حجم الاحتشاء وحدوث HT. أشار تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (H & E) إلى وجود آفات نزفية كبيرة داخل منطقة الاحتشاء في الفئران التي تعاني من ارتفاع السكر في الدم. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الفئران التي تعاني من ارتفاع السكر في الدم اضطرابا متفادا في BBB ، كما يتضح من التسرب الأكثر حدة ل Evans blue (EB) و FITC-Dextran. في الختام ، أدى ارتفاع السكر في الدم الحاد بشكل موثوق ومتسق إلى HT عياني في نموذج فأر من tMCAO. يوفر هذا النموذج القابل للتكرار أداة قيمة للتحقيق في الآليات المرضية ل HT وتطوير التدخلات العلاجية المقابلة.

Introduction

الاحتشاء الدماغي هو السبب الرئيسي للإعاقة والسبب الرئيسي الثاني للوفاة لدى البالغين في جميع أنحاءالعالم 1. تلعب المرحلة الحادة دورا مهما في تطور الاحتشاء الدماغي ، وتعمل كنقطة زمنية محورية لعلاج المرض. تعد الاستعادة المبكرة وفي الوقت المناسب لتدفق الدم في منطقة شبه الظلال أمرا ضروريا لمنع المزيد من موت خلايا الدماغ ، حيث يمثل انحلال التخثر والعلاج التداخلي الدعائم الأساسية لعلاج الاحتشاء الدماغي الحاد (ACI). ومع ذلك ، فإن التحول النزفي (HT) يشكل مضاعفات كبيرة بعد انحلال الخثرة والعلاج التدخلي ، يحدث في 15٪ -30٪ من المرضى الذين يعانون من السكتة الدماغية الإقفارية ، مما يحد من تطبيقها إلى حدما 2،3. يزيد حدوث HT بشكل كبير من خطر الوفيات والعجز ، مما يؤثر على تشخيص ACI. لذلك ، من الأهمية بمكان سريرية كبيرة التحقيق في الآليات المرضية ل HT وتحديد الأهداف العلاجية الفعالة.

حاليا ، يتم استخدام انسداد الشريان الدماغي الأوسط الناجم عن انسداد الخيط (MCAO) بشكل متكرر كنموذج ل HT في القوارض4. يمكن أن يؤدي الانسداد المطول إلى احتشاء دماغي هائل يشمل القشرة والمخطط ، مما قد يؤدي إلى HT الثانوي. لا يتطلب Thread MCAO بضع القحف ، وهو قابل للتكرار بدرجة كبيرة ، وينتج تلفا بؤريا في الدماغ و HT مشابه للسكتة الدماغية البشرية. ومع ذلك ، فإن هذا النموذج الميكانيكي له بعض العيوب المميزة ، بما في ذلك ارتفاع معدلات الوفيات المبكرة وانخفاض معدلات البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل5. نموذج HT آخر يستخدم بشكل متكرر هو نموذج انحلال الدم ، حيث يتم تحفيز تكوين جلطة دموية أولا في الوعاء المستهدف ، يليه استخدام أدوية تحلل الدم (على سبيل المثال ، rt-PA ، الوارفارين) لإذابة الجلطة ، مما يحاكي العملية السريرية ل HT في السكتة الدماغيةالإقفارية 6،7. على الرغم من تكرار العملية المرضية للعلاج الانحلال للتخثر السريري إلى حد كبير ، فإن النماذج الحيوانية HT التي يسببها rt-PA أو الوارفارين معقدة في التنفيذ وترتبط بارتفاع معدل وفيات بالإضافة إلى معدل حدوث وموقع متغير للنزيف. من أجل النهوض بالأبحاث الانتقالية الأساسية والسريرية حول HT بعد الاحتشاء الدماغي ، من الضروري إنشاء نموذج حيواني قابل للتكرار من HT يسهل تشغيله ويوفر ثباتا عاليا.

يعد ارتفاع السكر في الدم مساهما كبيرا في HT بعد نقص التروية الدماغية / إعادة التروية (I / R)8. قامت العديد من الدراسات بأثر رجعي بتحليل البيانات السريرية للمرضى الذين يخضعون لاستئصال الخثرة الميكانيكي ، وكشفت أن ارتفاع مستويات الجلوكوز في الدم عند الدخول يرتبط بارتفاع معدل الإصابة ب HT3 التلقائي. في مرضى السكتة الدماغية السكري ، يزيد ارتفاع السكر في الدم بشكل كبير من خطر الإصابة ب HT ويؤدي إلى عجز عصبي أكثر حدة9،10. طور الباحثون نماذج HT عن طريق تحفيز I / R الدماغي في نماذج السكري من خلال MCAO. ومع ذلك ، فإن نموذج مرض السكري-MCAO له مدة تجريبية طويلة ، وإجراء معقد ، وتكاليف عالية11،12. يمكن إنشاء نموذج موثوق به ل HT عن طريق إحداث ارتفاع السكر في الدم الحاد من خلال حقن الجلوكوز داخل الصفاق ودمجها مع نموذج I / R الدماغي الناتج عن تقنية الخياطة. يتم تنفيذ هذه الطريقة بسهولة مع وضع نزيف ثابت وتحاكي بشكل فعال السمات السريرية لارتفاع السكر في الدم بعد السكتة الدماغية. ومع ذلك ، هناك اختلافات كبيرة في الظروف الحاسمة مثل الوقت الإقفاري وتركيز الجلوكوز. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استقرار النموذج وحدوث HT غير متسقان في الأدبيات المختلفة.

استخدمت مجموعتنا البحثية على نطاق واسع طريقة ارتفاع السكر في الدم الحاد MCAO لإنشاء نموذج HT. علاوة على ذلك ، أجرينا سلسلة شاملة من التجارب لاستكشاف العلاقة بين الوقت الإقفاري ، وتركيز الجلوكوز في الدم ، ومعدل حدوث HT ، ووفيات. أدت هذه التجارب في النهاية إلى تحديد الظروف المثلى لإنشاء نموذج HT بعد الاحتشاء الدماغي. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا لإنشاء نموذج HT الناجم عن ارتفاع السكر في الدم باستخدام الحقن داخل الصفاق بنسبة 30٪ من الجلوكوز جنبا إلى جنب مع MCAO الصمي.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه بجامعة جيانغهان (JHDXLL2024-080) وتم إجراؤه وفقا للإرشادات الأخلاقية للحيوانات التجريبية الصادرة عن مركز السيطرة على الأمراض في الصين. تم استخدام الفئران البالغة C57BL / 6J التي تزن 21-26 جم في هذه الدراسة. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. التجميع الحيواني وارتفاع السكر في الدم الحاد

  1. ضع الفئران في مركز المختبر بجامعة جيانغهان في بيئة يتم التحكم فيها في دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة (20-22 درجة مئوية ، 50٪ -55٪ رطوبة) مع الطعام والماء المجاني .
  2. قسم الفئران بشكل عشوائي إلى أربع مجموعات: الشام + المحلول الملحي (ن = 12) ، شام + الجلوكوز (ن = 12) ، MCAO + محلول ملحي (ن = 12) ، و MCAO + الجلوكوز (ن = 20).

2. التحضير قبل الجراحة

ملاحظة: صامت جميع الفئران التجريبية لمدة 12 ساعة قبل الجراحة.

  1. تطبيق التسكين الجهازي (ميلوكسيكام، 5 ملغ/كغ تحت الجلد) والتخدير الموضعي في موضع الشق (بوبيفاكايين، 2 ملغ/كغ تحت الجلد) في الفترة المحيطة بالجراحة.
  2. تعقيم جميع الأدوات الجراحية ومسحات القطن والخيوط الجراحية عن طريق التعقيم في ظروف 121 درجة مئوية و 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 30 دقيقة.
  3. امسح المنصة الجراحية ومنطقة العمل المحيطة بها بنسبة 75٪ من الإيثانول ، وقم بتشغيل مفتاح التسخين مع ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.
  4. قم بتخدير الفأر بخليط غاز الأكسجين بنسبة 3٪ من الأيزوفلوران -20٪ في غرفة تحريض التخدير. بعد ذلك ، قم بتقييم منعكس قرصة إصبع القدم لاختبار عمق التخدير.
  5. حرك الماوس على المنصة الجراحية في وضع الانبطاح ، وأدخل أنف الماوس بسرعة في مخروط الأنف. افتح تدفق الغاز إلى مخروط الأنف ، وأغلق التدفق إلى غرفة تحريض التخدير. اضبط نسبة الأيزوفلوران على 2٪ واضبط تدفق خليط الغاز على 0.4 مل / دقيقة لصيانة التخدير.
  6. ضع جل العين على عيون الفأر للحفاظ على الرطوبة أثناء الجراحة.
  7. احلق شعر منطقة الرقبة باستخدام مقص. نظف البشرة وتطهيرها بالتناوب مع اليود و 70٪ إيثانول باستخدام عود قطن مطهر.
  8. قم بتغطية شاش معقم على الرقبة وقطع فتحة لفضح منطقة الجراحة.

3. قياس تدفق الدم الدماغي الأساسي

  1. حلق شعر منطقة فروة الرأس باستخدام ماكينة قص. نظف وتطهير فروة الرأس بالتناوب مع اليود و 70٪ إيثانول باستخدام عود قطن مطهر.
  2. قم بعمل شق خط الوسط بطول 1.0 سم في الجلد فوق المنطقة الأمامية لكشف اليافوخ القحمي. حافظ على رطوبة الجمجمة باستخدام محلول ملحي عادي.
  3. قم بإعداد أداة قياس التدفق بالليزر دوبلر (LDF) وامسك طرف مسبار LDF عموديا على سطح الجمجمة الجدرية اليسرى (1 مم خلفي و 5 مم جانبيا إلى البرجما) ؛ بمجرد أن يكون FLUX مستقرا وسجل قيمة خط الأساس.
    ملاحظة: وحدة قياس FLUX هي وحدات التروية (PU) ، بنطاق قياس من 0-1000 PU. CBF الأساسي المثالي على مقياس تدفق دوبلر بالليزر هو >600 PU. تعتبر الفترة المستمرة مدتها 5 ثوان مع نطاق تذبذب أقل من 10٪ قراءة FLUX صالحة.
  4. خياطة العضلات والجلد بشكل منفصل باستخدام خياطة قابلة للامتصاص 5.0 PGA. ضع جل الصوديوم ديكلوفيناك ومرهم الموبيروسين على الجرح.

4. إجراء جراحي MCAO

ملاحظة: يتم إجراء MCAO باستخدام طريقة انسداد الخيط المعدلة ، كما هو موضح سابقا من قبل Chiang et al.13.

  1. اقلب الماوس برفق إلى وضع ضعيف وقم بإعطاء جلوكوز 30٪ (7.2 مل / كجم) أو محلول ملحي طبيعي داخل الصفاق للفئران قبل 15 دقيقة من العملية الجراحية.
    ملاحظة: تلقت الفئران من مجموعات الجلوكوز الشامي + الجلوكوز و MCAO + الجلوكوز حقنا داخل الصفاق من الجلوكوز. تلقت الفئران من مجموعات Sham + salte و MCAO + المحلول الملحي حقنا داخل الصفاق من المحلول الملحي الطبيعي.
  2. احلق شعر منطقة الرقبة باستخدام ماكينة قص. نظف البشرة وتطهيرها بالتناوب مع اليود و 70٪ إيثانول باستخدام عود قطن مطهر. قم بتغطية شاش معقم على الرقبة وقطع فتحة لفضح منطقة الجراحة.
    ملاحظة: تأكد من إبقاء الشق مستقيما لتحقيق الرؤية المثلى للشريان السباتي.
  3. قم بعمل شق خط الوسط بطول 1.5 سم على الجانب البطني من الرقبة باستخدام مشرط. افصل الأنسجة تحت الجلد واللفافة السطحية باستخدام الملقط الجراحي.
    ملاحظة: تأكد من إبقاء الشق مستقيما لتحقيق الرؤية المثلى للشريان السباتي.
  4. تحت اللفافة السطحية ، حدد موقع الغدة تحت الفك السفلي ومثلث مقلوب يتكون من ثلاث عضلات: القص اللامي ، الموجود في خط الوسط فوق القصبة الهوائية. البطن الخلفي للعضلة الدجزية ، يمكن التعرف عليه من خلال الجزء الوتري الأبيض اللامع ؛ وأخيرا ، العضلة القصية.
  5. قم بإجراء تشريح حاد داخل المثلث المقلوب لتحديد وفصل الشريان السباتي المشترك الأيسر (CCA).
  6. قم بتشريح العصب المبهم المجاور ل CCA والأنسجة المخاطية المحيطة بالأوعية الدموية باستخدام ملقط العين. اصنع جرسا على CCA باستخدام خياطة قابلة للامتصاص 5.0 حمض بولي جليكوليك (PGA) ، لكن حافظ على الخيط غير متوتر.
  7. منفصلة لأعلى على طول CCA ، يمكن ملاحظة تشعب "Y" لتقسيم CCA إلى الشريان السباتي الخارجي (ECA) والشريان السباتي الداخلي (ICA).
  8. افصل التشعب لفضح ECA و ICA بالكامل. قم بلف وربط خياطة قابلة للامتصاص 5.0 PGA بإحكام حول ECA بعيدا عن التشعب.
    ملاحظة: تأكد من وجود مسافة كافية بين موقع الربط الدائم وتشعب الأوعية الدموية لمنع الخيط من الإزاحة أثناء دوران ECA.
  9. قم بتثبيت كل من CCA و ICA مؤقتا باستخدام مشابك شريان شريانية صغيرة خفيفة مقاس 8 مم × 2 مم لمنع تدفق الدم من CCA إلى ICA.
  10. قم بتمديد ربطة الخيط على ECA البعيد و CCA لتصويب جزء ECA.
  11. استخدم المقص الدقيق لعمل شق صغير بين ربطتي الخياطة على ECA.
  12. أدخل خياطة أحادية الشعيرات المطلية بالسيليكون (بطول 30 مم ، سيليكون مطلي 3-4 مم) في ECA. قم بلف وربط خياطة ثانية قابلة للامتصاص 5.0 PGA قليلا على ECA بالقرب من التشعب لمنع خياطة الشعيرات الأحادية من التراجع.
  13. قم بقطع ECA البعيد تماما إلى الربط الدائم وقم بإزالة ملقط الشريان من ICA.
  14. اسحب الخيط إلى تشعب CCA ، ثم اسحب بعناية وقم بتدوير جذع ECA. اضبط اتجاه إدخال الخيط وأدخله ببطء ، على بعد حوالي 9.0-10.0 مم من تشعب CCA إلى ICA ، لسد MCA.
  15. شد خياطة PGA الثانية القابلة للامتصاص حول ECA وإزالة مشبك الشريان من CCA.
  16. خياطة العضلات والجلد بشكل منفصل باستخدام خياطة قابلة للامتصاص 5.0 PGA. ضع جل الصوديوم ديكلوفيناك ومرهم الموبيروسين على الجرح.
  17. اقلب الماوس برفق إلى وضع الانبطاح وكرر الخطوة 3.4. لتسجيل تدفق الدم بعد انسداد MCA.
    ملاحظة: تم استبعاد الفئران التي أظهرت انخفاضا في تدفق الدم أقل من 40٪ من القيمة الأساسية بعد MCAO من الدراسة14.
  18. قم بتشغيل مفتاح التسخين لقفص الاسترداد مع ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. ضع الفأر في قفص الاسترداد خلال فترة ما بعد الانسداد (60 دقيقة).

5. إزالة الشعيرات الأحادية وإعادة التروية

  1. أعد تخدير الفأر كما هو موضح سابقا قبل انتهاء فترة الانسداد.
  2. قم بتثبيت CCA باستخدام مشبك شريان microclip.
  3. اسحب الشعيرات الأحادية جزئيا من ICA حتى يصبح الطرف المطلي بالسيليكون مرئيا من خلال ICA.
  4. ضع مشبك شريان مشبك آخر على ICA فوق الطرف المطلي بالسيليكون.
  5. اسحب الشعيرات الأحادية بالكامل وقم بربط جذع ECA بإحكام.
  6. قم بإزالة مشبك الشريان المجهري من ICA و CCA ، على التوالي.
  7. خياطة العضلات والجلد طبقة تلو الأخرى باستخدام خياطة قابلة للامتصاص 5.0 PGA.
  8. ضع الماوس في غرفة الاسترداد وراقب جميع الفئران حتى تستيقظ تماما. يتم تطبيق ميلوكسيكام (5 ملغ/كغ، تحت الجلد) لتخفيف الألم كل 12 ساعة لمدة تصل إلى 24 ساعة.

6. قياس نسبة الجلوكوز في الدم

ملاحظة: تم قياس مستويات الجلوكوز في الدم في النقاط الزمنية التالية: (1) قبل جراحة MCAO مباشرة (خط الأساس) ، (2) مباشرة بعد إدخال الشعيرات الأحادية (15 دقيقة بعد حقن الجلوكوز) ، (3) مباشرة بعد سحب الشعيرات الأحادية مباشرة بعد إدخال الشعيرات الأحادية (75 دقيقة بعد حقن الجلوكوز).

  1. امسح ذيل الفأر بكرة قطنية كحولية لجعل وريد الذيل مفرط الدم تماما.
  2. اقطع طرف الذيل بمقدار 1-2 مم باستخدام مقص جراحي.
  3. اضغط برفق على طول جذر الذيل إلى طرف الذيل ، مما يسهل تدفق الدم من الشق.
  4. ضع خزان امتصاص العينة لورقة الاختبار على حافة قطرة الدم.
    ملاحظة: سيتم سحب الدم إلى ورقة الاختبار بسبب تأثير الغرب.
  5. اقرأ قراءة جهاز قياس نسبة السكر في الدم وسجل النتيجة.
    ملاحظة: استبعد الفئران التي لم ترتفع مستويات الجلوكوز في الدم عن 10 مليمول / لتر بعد 15 دقيقة من حقن الجلوكوز.
  6. قم بإزالة أي دم فائض باستخدام كرة قطنية واضغط لوقف النزيف.

7. تلطيخ 2،3،5-كلوريد ثلاثي فينيلترازوليوم (TTC)

  1. القتل الرحيم للفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق لجرعة زائدة من البنتوباربيتال (300 ملغ/كغ).
  2. بمجرد أن يتوقف الماوس عن التنفس ، قم بتثبيته على الفور بوضعية ضعيفة.
  3. افتح الصدر باستخدام المقص ، واقطع الحجاب الحاجز لكشف القلب.
  4. أدخل إبرة حقن 23 جم في البطين الأيسر للفأر وشق الزائدة الدودية الأذنية بالمقص.
  5. قم بتعبئة 15 مل من المحلول الملحي العادي حتى يبدو السائل الذي يتم تصريفه من الزائدة الدودية الأذنية واضحا وشفافا.
  6. اقطع رأس الماوس وافتح فروة الرأس لكشف الجمجمة بالكامل باستخدام المقص. أدخل طرف المقص 2 مم قليلا أمام الخيط الإكليلي للجمجمة لفتحه.
  7. استخدم الملقط لإزالة أنسجة دماغ الفأر سليمة.
  8. ضع أنسجة المخ في ماتيروس دماغ القوارض وقم بتقطيعها إلى شرائح إكليلية بحجم 2 مم.
  9. انقل الشرائح إلى طبق 24 بئرا واحتضنها بمحلول TTC بنسبة 2٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  10. ابدأ تشغيل برنامج المسح وقم بتعيين إعدادات المعلمة على دقة 1200 نقطة في البوصة وتنسيق JPG لتحليل الصور.
  11. قم بقص أقسام الأنسجة من اللوحة المكونة من 24 بئرا باستخدام ملقط منحني وقم بترتيب الأقسام على لوحة المسح الزجاجي.
  12. امسح أقسام الأنسجة ضوئيا ثم قم بتصدير الصور لتحليل القياس.
  13. قم بقياس منطقة الاحتشاء عن طريق تصحيح تورم الأنسجة. اطرح المنطقة غير الاحتشائية للجانب المماثل من منطقة الجانب المقابل باستخدام برنامج ImageJ15. تقييم حجم الاحتشاء كنسبة مئوية من نصف الكرة المقابل. للحصول على تفاصيل إضافية حول تحليل منطقة الاحتشاء ، راجع Friedländer et al.16.

8. ملاحظة جيروس

  1. كرر الخطوات 7.1-7.8.
  2. قم بقص أقسام الأنسجة من ماتريكس الدماغ باستخدام ملقط منحني وقم بترتيب الأقسام الموجودة على لوحة المسح الزجاجي.
  3. افحص الأقسام الإكليلية للدماغ كما هو موضح في الخطوتين 7.10 و 7.12.

9. تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (H & E)

  1. كرر الخطوات 7.1-7.4. يتم ترشيح 15 مل من المحلول الملحي العادي ببطء، يليه نضح حوالي 15 مل من بارافورمالدهيد (PFA).
  2. كرر الخطوات 7.6-7.7. قم بإصلاح أنسجة المخ بنسبة 4٪ PFA لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. ضع أنسجة المخ الثابتة في مجفف الأنسجة الآلي للجفاف والتزجيج وغمر الشمع.
  4. قم بتضمين الأنسجة في شمع البارافين وقطع أنسجة المخ إلى شرائح إكليلية بسمك 5 ميكرومتر بواسطة ميكروتوم.
  5. قم بإزالة الشمع من الشريحة عن طريق غمرها في الزيلين ثلاث مرات ، مع كل غمر لمدة 8 دقائق. بعد ذلك ، اغمر الشريحة تدريجيا في محاليل الإيثانول ذات التركيزات المتناقصة (100٪ ، 95٪ ، 90٪ ، 80٪ ، 70٪) ، متبوعا بالماء المقطر ، مع كل خطوة تستمر 5 دقائق.
  6. تلطخ الشريحة بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة 3 دقائق. بعد ذلك ، قم بتمييزه عن طريق غمره في كحول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 5٪ لمدة 5 ثوان.
  7. احتضان الشريحة بمحلول اليوزين لمدة 1 دقيقة ، ثم قم بتجفيفها وهيالينها بمحلول الإيثانول المتدرج (90٪ ، 95٪ ، 100٪) والزيلين.
  8. قم بتركيب القسم براتنجات محايدة.
  9. التقط صورا لشرائح الدماغ الملطخة ب H & E تحت مجال ساطع باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

10. تحديد إيفانز بلو (EB) lekage

ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول هذا الإجراء ، يرجى الرجوع إلى Wang et al.17.

  1. حقن محلول إيفانز الأزرق (EB) بنسبة 2٪ (وزن / حجم) (2 مل / كجم) عبر الوريد الذيل بعد 23 ساعة من MCAO.
  2. كرر الخطوات 7.1-7.7 بعد ساعة واحدة من حقن EB ، والتقط صورة للدماغ بأكمله.
  3. ضع الدماغ في ماتيروس دماغ القوارض وقم بتقطيعه إلى شرائح بحجم 2 مم. افحص الأقسام الإكليلية للدماغ كما هو موضح في الخطوات 7.10-7.12 لمراقبة تسرب EB.
  4. قسم الشرائح إلى أجزاء يمنى ويسار ، وضع كل واحدة في أنبوب طرد مركزي.
  5. تجانس كل شريحة من أنسجة المخ في 50٪ حمض ثلاثي كلورو أسيتيك ، بنسبة 100 مجم من أنسجة المخ إلى 0.4 مل من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك.
  6. بعد تحضينها عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، قم بالطرد المركزي للجانس لمدة 30 دقيقة عند 10,000 × جم (عند 4 درجات مئوية).
  7. انقل السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي آخر وقم بتخفيفه أربعة أضعاف بالإيثانول.
  8. قم بقياس امتصاص السائل الطافي عند 620 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  9. قم بتحويل قيم الامتصاص إلى تركيز EB باستخدام منحنى قياسي ل EB في الإيثانول (على سبيل المثال ، عند 31.25 و 62.5 و 125 و 250 ميكروغرام / مل).
    ملاحظة: يتم تقديم النتيجة على شكل ميكروغرام من EB لكل جرام من أنسجة المخ.

11. تحديد تسرب FITC-Dextran

  1. حقن FITC-Dexterran (10 كيلو دالتون ، 6 مجم / مل ، مخفف في 0.01 مليون PBS ؛ 4 مل / كجم) في وريد الذيل بعد 24 ساعة من MCAO ، مما يسمح له بالدوران في الدم لمدة 10 دقائق.
  2. كرر الخطوات 7.1-7.7 لإجراء التروية وإزالة أنسجة المخ السليمة.
  3. قم بإصلاح أنسجة المخ في 4٪ PFA لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  4. انقل أنسجة المخ الثابتة إلى محلول السكروز بتركيزات متدرجة تبلغ 10٪ و 20٪ و 30٪ (مخففة في 0.01M PBS) للجفاف.
  5. قم بتضمين أنسجة المخ باستخدام مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) وقم بتقطيعه إلى أقسام أنسجة المخ بسمك 30 ميكرومتر. انقل الأقسام إلى شريحة مجهرية باستخدام حلقة تلقيح وتأكد من أنها تلتصق بسطح الشريحة.
  6. قم بتركيب أقسام أنسجة المخ باستخدام وسيط تركيب يحتوي على 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  7. ابدأ الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر وبرنامج التحكم الخاص به.
  8. قم بإصلاح شريحة المجهر على مرحلة الكائن وحدد موقع منطقة الاحتشاء تحت عدسة 200x.
  9. اضبط الدقة على 1024 × 1024 واضبط قيمة الكسب ووقت التعرض للحصول على أوضح صورة ممكنة.
  10. احصل على صور المنطقة الملطخة FITC-Dextern من الاحتشاء الدماغي تحت طول موجة إثارة يبلغ 488 نانومتر.

النتائج

الإجراء التجريبي لهذه الدراسة موضح في الشكل 1. باختصار ، خضعت الفئران ل MCAO الناجم عن انسداد الخيط لمدة 60 دقيقة ، تليها إعادة التروية. تم إعطاء الجلوكوز (30٪ في محلول ملحي عادي ، 7.2 مل / كجم من وزن الجسم) داخل الصفاق قبل 15 دقيقة من MCAO. تم قياس مستويات ال...

Discussion

تم تصميم البروتوكول الحالي لإنشاء نموذج حيواني موثوق به للتحول النزفي بعد السكتة الدماغية الإقفارية ، والذي يمكن أن يكرر الآثار الضارة لإعادة توعية الأوعية الدموية في ظل ظروف ارتفاع السكر في الدم. من بين عوامل الخطر المختلفة للسكتة الدماغية ، يرتبط مستوى الجلوكوز في ال...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح متضاربة للإفصاح عنها.

Acknowledgements

تم إنشاء الشكل 1 باستخدام برنامج BioRender (https://www.biorender.com/). تم دعم هذه الدراسة بمنح من المشروع التوجيهي لمؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة هوبي (رقم 2022CFC057).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)Sigma-Aldrich108380The dye for TTC staining
24-well culture plateCorning IncorporatedCLS3527The vessel for TTC staining
30% glucose injectionKelun PharmaceuticalH42021188Acute hyperglycemia induction
4% paraformaldehydeWuhan Servicebio Technology
Co., Ltd.		G1101Tissue fixation
5.0 Polyglycolic acid absorbable sutureJinhuan Medical Co., LtdKCR531Equipment for surgery
96-well culture plateCorning IncorporatedCLS3596EB content measuring
Anesthesia machineMidmark CorporationVMRAnesthesia for animal
Antifade Mounting Medium with DAPIBeyotime BiotechP0131Mount for tissue sections
Automation-tissue-dehydrating 
machine		Leica BiosystemsTP1020Dehydrate tissue
Confocal microscopyLeica BiosystemsSTELLARIS 5Image acquisition
Diclofenac sodium gelMaYinglong PharmaceuticalH10950214Analgesia for animal
Eosin staining solutionServicebio TechnologyG1001The dye for H&E staining
Evans BlueAladdinE104208EB staining
Eye gelGuangzhou PharmaceuticalH44023098Material for surgery
Fitc-dextranSigma-Aldrich60842-46-8BBB permeability assessing
Fluorescence microscopeOlympusBX51Image acquisition
Frozen microtomeLeica BiosystemsCM1900Use for frozen sections
GlucometerYuWell580Blood glucose measurement
Hematoxylin staining SolutionServicebioG1004The dye for H&E staining
IodineLircon20020059Material for surgery
IsofluraneRwd Life ScienceR510-22-10Anesthesia for animal
Laser doppler blood flow meterMoor InstrumentsmoorVMSBlood flow monitoring
MCAO SuturesRwd Life Science907-00023-01Material for surgery
MeloxicamBoehringer-IngelheimJ20160020Analgesia for animal
Microsurgical instrument kitRwd Life ScienceSP0003-MEquipment for surgery
MicrotomeThermo Fisher ScientificHM325Tissue section production
Microtome bladeLeica Biosystems819Tissue section production
Mupirocin ointmentGlaxoSmithKlineH10930064Anti-infection for animal
Neutral balsamAbsin Bioscienceabs9177Seal for H&E staining
Paraffin embedding centerThermo Fisher ScientificEC 350Produce paraffin blocks
Pentobarbital sodiumSigma-AldrichP3761Euthanasia for animal
Phosphate buffered salineBeyotime BiotechC0221ARinse for tissue section
ScannerEPSONV330Tissue scanning
ShaverShenzhen Codos Electrical Appliances Co.,Ltd.CP-9200Equipment for surgery
SpectrophotometerThermo Fisher Scientific1510-02362EB content measuring
Sucrose solutionShanghai Macklin Biochemical57-50-1Dehydration for tissue
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura4583Tissue embedding medium
Trichloroacetic acidSigma-AldrichT6399EB content measuring

References

  1. Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. Hyperacute management of ischemic strokes: JACC focus seminar. J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).
  2. Goncalves, A., et al. Thrombolytic tPA-induced hemorrhagic transformation of ischemic stroke is mediated by PKCβ phosphorylation of occludin. Blood. 140 (4), 388-400 (2022).
  3. Adebayo, O. D., Culpan, G. Diagnostic accuracy of computed tomography perfusion in the prediction of hemorrhagic transformation and patient outcome in acute ischaemic stroke: A systematic review and meta-analysis. Eur Stroke J. 5 (1), 4-16 (2020).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Knight, R. A., et al. Prediction of impending hemorrhagic transformation in ischemic stroke using magnetic resonance imaging in rats. Stroke. 29 (1), 144-151 (1998).
  6. Orset, C., et al. Combination treatment with U0126 and rt-PA prevents adverse effects of the delayed rt-PA treatment after acute ischemic stroke. Sci Rep. 11 (1), 11993 (2021).
  7. Kwon, I., et al. Hemorrhagic transformation after large cerebral infarction in rats pretreated with dabigatran or warfarin. Stroke. 48 (10), 2865-2871 (2017).
  8. Mi, D., et al. Correlation of hyperglycemia with mortality after acute ischemic stroke. Ther Adv Neurol Disord. 11, 1756285617731686 (2018).
  9. Seners, P., Turc, G., Oppenheim, C., Baron, J. C. Incidence, causes and predictors of neurological deterioration occurring within 24 following acute ischaemic stroke: A systematic review with pathophysiological implications. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 86 (1), 87-94 (2015).
  10. Reshi, R., et al. Hyperglycemia in acute ischemic stroke: Is it time to re-evaluate our understanding. Med Hypotheses. 107, 78-80 (2017).
  11. Graham, M. L., Schuurman, H. J. Validity of animal models of type 1 diabetes, and strategies to enhance their utility in translational research. Eur J Pharmacol. 759, 221-230 (2015).
  12. Rehni, A. K., Liu, A., Perez-Pinzon, M. A., Dave, K. R. Diabetic aggravation of stroke and animal models. Exp Neurol. 292, 63-79 (2017).
  13. Chiang, T., Messing, R. O., Chou, W. H. Mouse model of middle cerebral artery occlusion. J Vis Exp. 48, e2761 (2011).
  14. Ma, F., Sun, P., Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. Endothelium-targeted deletion of the miR-15a/16-1 cluster ameliorates blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke. Sci Signal. 13 (621), eaay5686 (2020).
  15. Wanson, R. A., et al. A semiautomated method for measuring brain infarct volume. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (2), 290-293 (1990).
  16. Friedländer, F., et al. Reliability of infarct volumetry: Its relevance and the improvement by a software-assisted approach. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (8), 3015-3026 (2017).
  17. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588 (2014).
  18. Wang, C., et al. Association between red blood cell distribution width and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke patients. Cerebrovasc Dis. 48 (3-6), 193-199 (2019).
  19. Zhu, B., et al. Stress hyperglycemia and outcome of non-diabetic patients after acute ischemic stroke. Front Neurol. 10, 1003 (2019).
  20. Won, S. J., Tang, X. N., Suh, S. W., Yenari, M. A., Swanson, R. A. Hyperglycemia promotes tissue plasminogen activator-induced hemorrhage by increasing superoxide production. Ann Neurol. 70 (4), 583-590 (2011).
  21. Zhang, F. H., et al. Rosiglitazone attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal ischemia in rats. Neuroscience. 250, 651-657 (2013).
  22. Soejima, Y., et al. Hyperbaric oxygen preconditioning attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient MCAO in rats. Med Gas Res. 2 (1), 9 (2012).
  23. Chen, C., Ostrowski, R. P., Zhou, C., Tang, J., Zhang, J. H. Suppression of hypoxia-inducible factor-1alpha and its downstream genes reduces acute hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation in a rat model of cerebral ischemia. J Neurosci Res. 88 (9), 2046-2055 (2010).
  24. Lin, Y., et al. Docosahexaenoic acid attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal cerebral ischemia in rats. Neuroscience. 301, 471-479 (2015).
  25. MacDougal, E. L., Herman, W. H., Wing, J. J., Morgenstern, L. B., Lisabeth, L. D. Diabetes and ischaemic stroke outcome. Diabet Med. 35 (9), 1249-1257 (2018).
  26. Yang, C., Hawkins, K. E., Doré, S., Candelario-Jalil, E. Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke. Am J Physiol Cell Physiol. 316 (2), C135-C153 (2019).
  27. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Curr Protoc Neurosci. 79, 9.58.1-9.58.15 (2017).
  28. Ahishali, B., Kaya, M. Evaluation of blood-brain barrier integrity using vascular permeability markers: Evans Blue, Sodium Fluorescein, Albumin-Alexa Fluor conjugates, and Horseradish Peroxidase. Methods Mol Biol. 2367, 87-103 (2021).
  29. Kovács, K. B., Bencs, V., Hudák, L., Oláh, L., Csiba, L. Hemorrhagic transformation of ischemic strokes. Int J Mol Sci. 24 (18), 14067 (2023).

Erratum


Formal Correction: Erratum: A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia
Posted by JoVE Editors on 1/06/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/67371

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

C57BL 6J

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved