Un modelo murino de transformación hemorrágica inducida por hiperglucemia aguda combinada con isquemia focal transitoria

Este estudio presenta un protocolo para establecer un modelo animal altamente reproducible de transformación hemorrágica (HTA) utilizando la oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media (MCAO/R) en ratones C57BL/6 con hiperglucemia aguda.

La transformación hemorrágica (HTA) es una complicación grave que puede ocurrir como resultado de la terapia trombolítica después de un accidente cerebrovascular isquémico (IS), y plantea limitaciones significativas en la aplicación clínica del activador tisular recombinante del plasminógeno (rt-PA). Desafortunadamente, actualmente no existen intervenciones efectivas disponibles para la TH en la práctica clínica. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de modelos animales experimentales estables y confiables para dilucidar la patogénesis de la HTA y desarrollar estrategias de intervención efectivas. En este estudio se presentó un protocolo para establecer un modelo murino de HTA inducida por hiperglucemia aguda combinada con isquemia focal transitoria (tMCAO). A los ratones machos C57BL/6J se les inyectó glucosa al 30% para inducir hiperglucemia y luego se les sometió a 60 min de tMCAO con reperfusión. Se evaluó el volumen del infarto, la integridad de la barrera hematoencefálica (BHE) y el grado de hemorragia intracraneal a las 24 h después de la OMC. Los resultados mostraron que la inyección de glucosa condujo a una hiperglucemia transitoria (14,3-20,3 mmol/L), lo que aumentó significativamente tanto el volumen del infarto como la incidencia de HTA. La tinción con hematoxilina-eosina (H&E) indicó lesiones hemorrágicas significativas dentro de la zona de infarto en ratones hiperglucémicos. Además, los ratones hiperglucémicos mostraron una interrupción agravada de la BBB, como lo demuestra una fuga más severa de azul de Evans (EB) y FITC-Dextrano. En conclusión, la hiperglucemia aguda resultó de manera confiable y consistente en HTA macroscópica en un modelo murino de tMCAO. Este modelo reproducible ofrece una valiosa herramienta para investigar los mecanismos patológicos de la HTA y desarrollar las intervenciones terapéuticas correspondientes.

El infarto cerebral es la principal causa de discapacidad y la segunda causa de muerte en adultos en todo el mundo¹. La fase aguda desempeña un papel crucial en la progresión del infarto cerebral, sirviendo como un punto de tiempo crucial para el tratamiento de la enfermedad. El restablecimiento temprano y oportuno del flujo sanguíneo en el área de la penumbra es esencial para prevenir una mayor muerte de las células cerebrales, y la trombólisis y la terapia intervencionista representan los pilares para el tratamiento del infarto cerebral agudo (ICA). Sin embargo, la transformación hemorrágica (HTA) presenta una complicación significativa después de la trombólisis y el tratamiento intervencionista, ocurriendo en el 15-30% de los pacientes con accidente cerebrovascular isquémico, lo que limita su aplicación en cierta medida ^2,3. La aparición de HTA aumenta significativamente el riesgo de mortalidad y discapacidad, afectando el pronóstico de la ACI. Por lo tanto, es de gran importancia clínica investigar los mecanismos patológicos de la HTA e identificar dianas terapéuticas eficaces.

En la actualidad, la oclusión de la arteria cerebral media (OAMI) inducida por embolia con hilos se utiliza con frecuencia como modelo de HTA en roedores⁴. La obstrucción prolongada puede provocar un infarto cerebral masivo que afecta a la corteza y al cuerpo estriado, lo que puede conducir a una HTA secundaria. Thread MCAO no requiere craneotomía, es altamente reproducible y produce daño cerebral focal y HTA similar a un accidente cerebrovascular humano. Sin embargo, este modelo mecánico tiene algunas desventajas distintivas, incluyendo altas tasas de mortalidad temprana y bajas tasas de supervivencia a largo plazo⁵. Otro modelo de HTA frecuentemente utilizado es el modelo de trombólisis, en el que se induce primero la formación de coágulos sanguíneos en el vaso diana, seguido del uso de fármacos trombolíticos (p. ej., rt-PA, warfarina) para disolver el coágulo, imitando el proceso clínico de la HTA en el ictus isquémico ^6,7. A pesar de replicar en gran medida el proceso patológico de la terapia trombolítica clínica, los modelos animales de HTA inducidos por rt-PA o warfarina son complicados de implementar y se asocian con una alta mortalidad animal, así como con una incidencia y localización variables de la hemorragia. Con el fin de avanzar en la investigación básica y clínica traslacional sobre la HTA después de un infarto cerebral, es esencial establecer un modelo animal reproducible de HTA que sea fácil de operar y ofrezca una alta estabilidad.

La hiperglucemia contribuye significativamente a la HTA tras isquemia/reperfusión cerebral (I/R)⁸. Varios estudios retrospectivos han analizado los datos clínicos de los pacientes sometidos a trombectomía mecánica, revelando que los niveles elevados de glucosa en sangre al ingreso se relacionan con una mayor incidencia de HTA espontánea³. En los pacientes diabéticos con accidente cerebrovascular, la hiperglucemia aumenta significativamente el riesgo de HTA y conduce a déficits neurológicos más severos ^9,10. Los investigadores han desarrollado modelos de HT mediante la inducción de I/R cerebral en modelos animales diabéticos a través de MCAO. Sin embargo, el modelo diabetes-MCAO tiene una larga duración experimental, un procedimiento complejo y altos costos^11,12. Se puede establecer un modelo fiable de HTA mediante la inducción de hiperglucemia aguda mediante inyección intraperitoneal de glucosa e integrándola con un modelo de I/R cerebral generado por la técnica de sutura. Este método se realiza fácilmente con una posición de sangrado constante e imita eficazmente las características clínicas de la hiperglucemia posterior a un accidente cerebrovascular. Sin embargo, existen diferencias significativas en condiciones cruciales como el tiempo isquémico y la concentración de glucosa; además, la estabilidad del modelo y la incidencia de HTA son inconsistentes en diferentes literaturas.

Nuestro grupo de investigación utilizó ampliamente el método de hiperglucemia aguda-MCAO para establecer un modelo de HTA. Además, llevamos a cabo una serie completa de experimentos para explorar la relación entre el tiempo isquémico, la concentración de glucosa en sangre, la tasa de incidencia de HTA y la mortalidad animal. Estos experimentos condujeron finalmente a la identificación de las condiciones óptimas para crear un modelo de HTA post-infarto cerebral. Este estudio presenta un protocolo detallado para establecer un modelo de HTA inducida por hiperglucemia aguda utilizando la inyección intraperitoneal de glucosa al 30% combinada con MCAO embólico.

El protocolo experimental fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Jianghan (JHDXLL2024-080) y se llevó a cabo de acuerdo con las Directrices Éticas de Animales Experimentales emitidas por el Centro para el Control de Enfermedades de China. En este estudio se utilizaron ratones machos adultos C57BL/6J con un peso de 21 a 26 g. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Agrupamiento de animales e inductor de hiperglucemia aguda

1. Aloje a los ratones en el centro de animales de laboratorio de la Universidad de Jianghan en un ambiente controlado de ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (20-22 °C, 50%-55% de humedad) con comida y agua ad libitum.
2. Divida aleatoriamente los ratones en cuatro grupos: Sham + solución salina (n = 12), Sham + glucosa (n = 12), MCAO + solución salina (n = 12) y MCAO + glucosa (n = 20).

2. Preparación preoperatoria

NOTA: Todos los ratones experimentales ayunaron durante 12 h antes de la cirugía.

1. Administrar analgesia sistémica (meloxicam, 5 mg/kg subcutáneo) y anestesia local en el sitio de la incisión (bupivacaína, 2 mg/kg subcutáneo) durante el preoperatorio.
2. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos, hisopos de algodón y suturas quirúrgicas mediante autoclave en condiciones de 121 °C y 15 psi durante 30 min.
3. Limpie la plataforma quirúrgica y el área de trabajo circundante con etanol al 75% y encienda el interruptor de calefacción con la temperatura ajustada a 37 °C.
4. Anestesiar al ratón con una mezcla de gas de isoflurano al 3% y oxígeno al 20% en la cámara de inducción de anestesia. Luego, evalúe el reflejo de pellizco del dedo del pie para probar la profundidad de la anestesia.
5. Mueva el mouse en la plataforma quirúrgica en posición prona e inserte rápidamente la nariz del mouse en el cono de la nariz. Abra el flujo de gas al cono de la nariz, cerrando el flujo a la cámara de inducción de anestesia. Ajuste la proporción de isoflurano al 2% y ajuste el flujo de la mezcla de gases a 0,4 mL/min para el mantenimiento de la anestesia.
6. Aplique gel para los ojos del ratón para mantener la humedad durante la cirugía.
7. Afeita el pelo de la región del cuello con la maquinilla para animales. Limpiar y desinfectar la piel alternando la aplicación con yodo y etanol al 70% con un algodón desinfectante.
8. Cubra una gasa estéril en el cuello y corte una abertura para exponer la región operatoria.

3. Medición basal del flujo sanguíneo cerebral

1. Afeitar el pelo de la región del cuero cabelludo con la maquinilla de animales. Limpiar y desinfectar el cuero cabelludo alternando la aplicación con yodo y etanol al 70% con un algodón en barra desinfectante.
2. Realice una incisión de 1,0 cm de largo en la línea media de la piel sobre la región frontal para exponer la fontanela craneal. Mantenga el cráneo húmedo con solución salina normal.
3. Prepare el instrumento de flujometría láser Doppler (LDF) y sostenga la punta de la sonda LDF perpendicular a la superficie del cráneo parietal izquierdo (1 mm posterior y 5 mm lateral al bregma); una vez que el FLUX es estable y registre el valor de referencia.
   NOTA: La unidad de medida de FLUX son las unidades de perfusión (PU), con un rango de medición de 0-1000 PU. El CBF de referencia ideal en una flujometría láser Doppler es >600 PU. Un período continuo de 5 segundos con un rango de fluctuación inferior al 10% se considera una lectura FLUX válida.
4. Sutura el músculo y la piel por separado con sutura absorbible 5.0 PGA. Aplique gel de diclofenaco sódico y ungüento de mupirocina en la herida.

4. Procedimiento quirúrgico MCAO

NOTA: El MCAO se realiza utilizando un método de oclusión de rosca modificado, como se describió previamente por Chiang et ^al.13.

1. Girar suavemente el ratón a una posición supina y administrar por vía intraperitoneal glucosa al 30% (7,2 mL/kg) o solución salina normal a los ratones 15 minutos antes del procedimiento quirúrgico.
   NOTA: Los ratones de los grupos Sham + glucosa y MCAO + glucosa recibieron inyecciones intraperitoneales de glucosa. Los ratones de los grupos Sham + solución salina y MCAO + solución salina recibieron inyecciones intraperitoneales de solución salina normal.
2. Afeitar el pelo de la región del cuello con la maquinilla para animales. Limpiar y desinfectar la piel alternando la aplicación con yodo y etanol al 70% con un algodón desinfectante. Cubra una gasa estéril en el cuello y corte una abertura para exponer la región operatoria.
   NOTA: Asegúrese de que la incisión se mantenga recta para lograr una visualización óptima de la arteria carótida.
3. Realice una incisión de 1,5 cm en la línea media en la cara ventral del cuello con un bisturí. Separe el tejido subcutáneo y la fascia superficial con pinzas quirúrgicas.
   NOTA: Asegúrese de que la incisión se mantenga recta para lograr una visualización óptima de la arteria carótida.
4. Debajo de la fascia superficial se ubica la glándula submandibular y un triángulo invertido formado por tres músculos: el esternohioideo, situado en la línea media sobre la tráquea; el vientre posterior del músculo digástrico, reconocible por su parte tendinosa blanca brillante; y por último, el músculo esternomastoideo.
5. Realizar una disección roma dentro del triángulo invertido para identificar y separar la arteria carótida común izquierda (ACC).
6. Diseccionar el nervio vago adyacente al CCA y el tejido mucoso que rodea los vasos sanguíneos con pinzas oftálmicas. Haga un timbre en CCA usando una sutura absorbible de ácido poliglicólico 5.0 (PGA), pero mantenga la sutura sin tensionar.
7. Separada hacia arriba a lo largo del CCA, se puede observar una bifurcación en "Y" para dividir el CCA en la arteria carótida externa (ECA) y la arteria carótida interna (ACI).
8. Separe la bifurcación para exponer completamente el ECA y el ICA. Enrolle y ate firmemente una sutura absorbible de 5.0 PGA alrededor del ECA distalmente desde la bifurcación.
   NOTA: Asegúrese de que haya una distancia suficiente entre el sitio de ligadura permanente y la bifurcación vascular para evitar que el hilo se desprenda durante la rotación del ECA.
9. Pinzar temporalmente tanto el ACC como el ACI con dos pinzas arteriales micro serrafinas ligeras de 8 mm x 2 mm para bloquear el flujo sanguíneo del ACC al ACI.
10. Estire la atadura de sutura en el ECA distal y el CCA para enderezar el segmento ECA.
11. Use unas microtijeras para hacer una pequeña incisión entre las dos ataduras de sutura en el ECA.
12. Inserte una sutura de monofilamento recubierta de silicona (30 mm de largo, silicona recubierta de 3-4 mm) en el ECA. Enrolle y ate ligeramente una segunda sutura absorbible 5.0 PGA en el ECA cerca de la bifurcación para evitar que la sutura de monofilamento se retraiga.
13. Corte completamente el ECA distal a la ligadura permanente y retire la pinza de pinza arterial del ICA.
14. Retire la sutura hasta la bifurcación del CCA, luego retraiga y gire con cuidado el muñón ECA. Ajuste la dirección de inserción de la sutura e insértela lentamente, aproximadamente a 9,0-10,0 mm de la bifurcación del CCA en el ICA, para ocluir el MCA.
15. Apriete la segunda sutura absorbible PGA alrededor del ECA y retire la pinza arterial del CCA.
16. Sutura el músculo y la piel por separado con sutura absorbible 5.0 PGA. Aplique gel de diclofenaco sódico y ungüento de mupirocina en la herida.
17. Gire suavemente el ratón a la posición prona y repita el paso 3.4. para registrar el flujo sanguíneo después de la oclusión de MCA.
    NOTA: Se excluyeron del estudio los ratones que presentaban una reducción del flujo sanguíneo inferior al 40% del valor basal después de la MCAO¹⁴.
18. Encienda el interruptor de calefacción de la jaula de recuperación con la temperatura ajustada a 37 ° C. Coloque el ratón en la jaula de recuperación durante el período posterior a la oclusión (60 min).

5. Eliminación y reperfusión de monofilamento

1. Vuelva a anestesiar al ratón como se describió anteriormente justo antes de que termine el período de oclusión.
2. Pinza el CCA con una pinza arterial de microclip.
3. Retraiga parcialmente el monofilamento del ICA hasta que la punta recubierta de silicona se haga visible a través del ICA.
4. Coloque otra pinza arterial microclip en el ICA por encima de la punta recubierta de silicona.
5. Retire completamente el monofilamento y ate firmemente el muñón ECA.
6. Retire la pinza arterial microclip de ICA y CCA, respectivamente.
7. Sutura el músculo y la piel capa por capa con sutura absorbible 5.0 PGA.
8. Coloque el mouse en la cámara de recuperación y monitoree a todos los ratones hasta que estén completamente despiertos. Administrar meloxicam (5 mg/kg, por vía subcutánea) para aliviar el dolor cada 12 h durante un máximo de 24 h.

6. Medición de glucosa en sangre

NOTA: Los niveles de glucosa en sangre se midieron en los siguientes puntos temporales: (1) justo antes de la cirugía MCAO (línea de base), (2) inmediatamente después de la inserción del monofilamento (15 minutos después de la inyección de glucosa), (3) inmediatamente después de la retirada del monofilamento inmediatamente después de la inserción del monofilamento (75 minutos después de la inyección de glucosa).

1. Limpie la cola del ratón con una bola de algodón alcohólico para hacer que la vena de la cola sea completamente hiperémica.
2. Corta la punta de la cola 1-2 mm con unas tijeras quirúrgicas.
3. Apriete suavemente a lo largo de la raíz de la cola hasta la punta de la cola, facilitando que la sangre fluya fuera de la incisión.
4. Coloque el tanque de absorción de muestras del papel de prueba en el borde de la gota de sangre.
   NOTA: La sangre se introducirá en el papel de prueba debido al efecto de sifón.
5. Lea la lectura del medidor de glucosa en sangre y registre el resultado.
   NOTA: Excluya a los ratones cuyos niveles de glucosa en sangre no superaron los 10 mmol/L después de 15 minutos de inyección de glucosa.
6. Retire el exceso de sangre con una bola de algodón y aplique presión para detener el sangrado.

7. Tinción de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)

1. Eutanasia del ratón mediante inyección intraperitoneal de una sobredosis de pentobarbital (300 mg/kg).
2. Una vez que el ratón deje de respirar, inmovilícelo rápidamente en posición supina.
3. Abra el tórax con unas tijeras y corte el diafragma para exponer el corazón.
4. Inserte una aguja de inyección de 23 G en el ventrículo izquierdo del ratón e incida el apéndice auricular con unas tijeras.
5. Perfunda 15 mL de solución salina normal hasta que el líquido que drena del apéndice auricular parezca claro y transparente.
6. Decapita al ratón y corta el cuero cabelludo para exponer completamente el cráneo con unas tijeras. Inserte la punta de la tijera 2 mm ligeramente por delante de la sutura coronal del cráneo para abrirla.
7. Use pinzas para extraer el tejido cerebral del ratón intacto.
8. Coloque el tejido cerebral en una matrica de cerebro de roedor y córtelo en rodajas coronales de 2 mm.
9. Transfiera las rodajas a una placa de 24 pocillos e incélelas con una solución de TTC al 2% a 37 °C durante 15 min.
10. Inicie el software de escaneo y establezca la configuración de los parámetros en una resolución de 1200 ppp y un formato JPG para el análisis de imágenes.
11. Recorte las secciones de tejido de la placa de 24 pocillos con pinzas curvas y coloque las secciones en la placa de escaneo de vidrio.
12. Escanee las secciones de tejido y, a continuación, exporte las imágenes para el análisis de medición.
13. Mida el área del infarto corrigiendo la hinchazón del tejido. Reste el área no infarto del lado ipsilateral del área del lado contralateral utilizando el software ImageJ¹⁵. Evaluar el tamaño del infarto como porcentaje del hemisferio contralateral. Para más detalles sobre el análisis del área de infarto, consultar Friedländer et ^al.16.

8. Observaciónde G ross

1. Repita los pasos 7.1 a 7.8.
2. Recorte las secciones de tejido de la matriz cerebral con pinzas curvas y coloque las secciones en la placa de escaneo de vidrio.
3. Escanee las secciones coronales del cerebro como se describe en los pasos 7.10 y 7.12.

9. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)

1. Repita los pasos 7.1 a 7.4. Perfundir lentamente 15 mL de solución salina normal, seguido de una perfusión de aproximadamente 15 mL de paraformaldehído (PFA).
2. Repita los pasos 7.6 y 7.7. Fijar el tejido cerebral con PFA al 4% durante 24 h a temperatura ambiente.
3. Coloque el tejido cerebral fijo en el deshidratador de tejido automatizado para la deshidratación, la vitrificación y la inmersión en cera.
4. Incruste el tejido en cera de parafina y corte el tejido cerebral en rodajas coronales de 5 μm de grosor mediante un micrótomo.
5. Desparafina la rodaja sumergiéndola en xileno tres veces, cada inmersión dura 8 minutos. Luego, sumerja gradualmente la rebanada en soluciones de etanol de concentraciones decrecientes (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), seguido de agua destilada, con cada paso durando 5 minutos.
6. Tiñe la rebanada con solución de hematoxilina durante 3 min. Luego, diferéncielo sumergiéndolo en alcohol de ácido clorhídrico al 5% durante 5 s.
7. Incubar la rodaja con solución de eosina durante 1 min, luego deshidratarla e hialinizarla con solución de etanol de gradiente (90%, 95%, 100%) y xileno.
8. Monta la sección con resinas neutras.
9. Capture las imágenes de cortes de cerebro teñidos con H&E bajo un campo brillante utilizando microscopía de fluorescencia.

10. Determinación de Evans Blue (EB) lekage

NOTA: Para más detalles sobre este procedimiento, véase Wang et ^al.17.

1. Inyecte una solución Evans Blue (EB) al 2% (p/v) (2 mL/kg) a través de la vena de cola 23 h después de la MCAO.
2. Repita los pasos 7.1 a 7.7 una hora después de la inyección de EB y capture una foto de todo el cerebro.
3. Coloque el cerebro en una matriz de cerebro de roedor y córtelo coronalmente en rodajas de 2 mm. Explora las secciones coronales del cerebro como se describe en los pasos 7.10 a 7.12 para observar la fuga de EB.
4. Divida las rodajas en porciones derecha e izquierda, y coloque cada una en un tubo de centrífuga.
5. Homogeneizar cada rebanada de tejido cerebral en ácido tricloroacético al 50%, con una proporción de 100 mg de tejido cerebral por 0,4 ml de ácido tricloroacético.
6. Después de incubar a 4 °C durante la noche, centrifugar el homogeneizado durante 30 min a 10.000 x g (a 4 °C).
7. Transfiera el líquido sobrenadante a otro tubo de centrífuga y dilúyalo cuatro veces con etanol.
8. Mida la absorbancia del líquido sobrenadante a 620 nm utilizando un espectrofotómetro.
9. Convierta los valores de absorbancia a la concentración de EB utilizando una curva estándar de EB en etanol (por ejemplo, a 31.25, 62.5, 125 y 250 ug/mL).
   NOTA: El resultado se presenta como un microgramo de EB por gramo de tejido cerebral.

11. Determinación de la fuga de FITC-Dextrano

1. Inyectar FITC-Dextrano (10 KDa, 6 mg/mL, diluido en 0,01M PBS; 4 mL/kg) en la vena de cola 24 h después de la MCAO, permitiendo que circule en la sangre durante 10 min.
2. Repita los pasos 7.1 a 7.7 para realizar la perfusión y extraer el tejido cerebral intacto.
3. Fije el tejido cerebral en PFA al 4% durante 24 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
4. Transfiera el tejido cerebral fijo a la solución de sacarosa con concentraciones de gradiente de 10%, 20% y 30% (diluido en 0,01M PBS) para la deshidratación.
5. Incruste el tejido cerebral utilizando un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y córtelo en secciones de tejido cerebral de 30 μm de grosor. Transfiera las secciones a un portaobjetos de microscopio utilizando un asa de inoculación y asegúrese de que se adhieran a la superficie del portaobjetos.
6. Monte las secciones de tejido cerebral utilizando un medio de montaje que contenga 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
7. Ponga en marcha la microscopía confocal láser y su software de control.
8. Fije el portaobjetos del microscopio en la platina del objeto y localice el área del infarto debajo del ocular de 200x.
9. Establezca la resolución en 1024 x 1024 y ajuste el valor de ganancia y el tiempo de exposición para obtener la imagen más clara posible.
10. Adquiera las imágenes de la región teñida con FITC-Dextrano del infarto cerebral bajo una longitud de onda de excitación de 488 nm.

El procedimiento experimental de este estudio se ilustra en la Figura 1. Brevemente, los ratones se sometieron a MCAO inducida por oclusión de hilos durante 60 minutos, seguido de reperfusión. La glucosa (30% en solución salina normal, 7,2 mL/kg de peso corporal) se administró por vía intraperitoneal 15 min antes de la MCAO. Los niveles de glucosa en sangre se midieron al inicio del estudio (antes de la inyección de glucosa), inmediat...

El protocolo actual está diseñado para crear un modelo animal fiable de transformación hemorrágica tras un accidente cerebrovascular isquémico, que pueda replicar los efectos nocivos de la revascularización de vasos en condiciones hiperglucémicas. Entre los diversos factores de riesgo para el accidente cerebrovascular isquémico, el nivel de glucosa en sangre dentro de las 24 horas posteriores al inicio del accidente cerebrovascular se correlaciona positivamente con la exacerbaci?...

Los autores no tienen intereses contrapuestos que revelar.

La Figura 1 se creó con el software BioRender (https://www.biorender.com/). Este estudio contó con el apoyo de subvenciones del proyecto rector de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hubei (No. 2022CFC057).

This corrects the article 10.3791/67371