Моделирование постгеморрагической гидроцефалии недоношенных у крыс

Постгеморрагическая гидроцефалия недоношенных (ПГГП) может быть смоделирована у неонатальных крыс путем сочетания хориоамнионита и внутрижелудочкового кровоизлияния. Комбинация этих пренатальных и постнатальных событий точно повторяет клинические признаки ПГПГ, включая макроцефалию, вентрикуломегалию и повышенное внутричерепное давление, на протяжении всей жизни.

Постгеморрагическая гидроцефалия недоношенных (ПГГП) является серьезным последствием тяжелого внутрижелудочкового кровоизлияния (ВЖК) у глубоко недоношенных детей в возрасте до 32 недель гестационного возраста (ГА). ПГГ определяется накоплением спинномозговой жидкости (ликвора), связанным с клиническими симптомами повышенного внутричерепного давления (ВЧД). Младенцы с ПГПГ страдают от пожизненной зависимости от шунтов, при этом половине из них требуется повторная операция в первый год жизни, а многим требуется несколько дополнительных операций на протяжении всей жизни. Пренатальный хориоамнионит предрасполагает недоношенных детей к тяжелому течению ВЖК и необходимости хирургического лечения тенденций ПГВП с неонатальным сепсисом. Эти клинические особенности позволяют предположить, что системное воспаление является неотъемлемым компонентом патофизиологии ПГПГ.

Здесь мы определяем животную модель, которая обобщает все клинические аспекты и основные особенности PHHP у крыс. Цель этого протокола — проиллюстрировать, как внутриутробный хориоамнионит и постнатальная ВЖК с использованием лизированных эритроцитов могут сочетаться для получения ПГПГ. Этот доклинический подход приводит к прогрессирующей макроцефалии и куполообразному черепу, повышенному внутричерепному давлению и вентрикуломегалии, которые могут быть обнаружены с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) или микроскопии. В дополнение к устойчивому нарушению динамики спинномозговой жидкости, крысы также имеют задержку когнитивных способностей и функциональную инвалидность во взрослом возрасте. Соответственно, эта доклиническая платформа способствует уникальным и беспрецедентным трансляционным исследованиям PHHP, которые могут включать молекулярные, клеточные, биохимические, гистологические показатели, визуализацию и функциональные исходы. Он также может быть использован для тщательного анализа сосудистого сплетения, эпендимальных подвижных ресничек и глимфатической системы параллельно. Наконец, он также может быть бесценным доклиническим инструментом для исследования новых стратегий хирургического вмешательства и нехирургических терапевтических подходов к лечению гидроцефалии.

Постгеморрагическая гидроцефалия недоношенных (ПГГП) остается существенной проблемой общественного здравоохранения. Определяемая симптоматическим накоплением спинномозговой жидкости (СМЖ) в сочетании с повышенным внутричерепным давлением (ВЧД) на фоне внутрижелудочкового кровоизлияния (ВЖК), ПГП является тяжелым проявлением энцефалопатии недоношенных и вносит значительный вклад в глобальное бремя недоношенных и приобретенной гидроцефалии ^1,2. Во всем мире ежегодно около 400 000 младенцев рождаются с гидроцефалией или приобретают пожизненное бремя гидроцефалии3^{, и} многие умирают из-за отсутствия лечения3. ПГЖ широко распространена в развитых странах у глубоко недоношенных детей (<32 недели гестации) с тяжелым течением ВЖК и часто поражает наиболее больных младенцев, которые уже страдают от других угрожающих жизни сопутствующих заболеваний ^4,5.

Единственным доступным методом лечения гидроцефалии является хирургическое вмешательство⁶. Хирургические процедуры обеспечивают большую продолжительность жизни, когда младенцы старше 6 месяцев на момент первого постоянного вмешательства, будь то вентрикулоперитонеальный шунт (ВП) для отведения спинномозговой жидкости (ликвор), эндоскопическая третья вентрикулостомия (ЭТВ) или ЭТВ с коагуляцией сосудистого сплетения (ЭТВ-ЦПХ)⁷. Наиболее распространенный вариант, VP-шунты, часто терпят неудачу в течение года и предрасполагают детей к осложнениям, повторным операциям и госпитализациям, что дорого обходится ребенку, семье и обществу. ⁸ В частности, беспокойство из-за того, что шунт может выйти из строя в любое время, является обременительным для семей⁹. Уход за детьми с симптоматической гидроцефалией, включая частые операции, является основной причиной расходов на педиатрическое здравоохранение 10,11,12,13,14. Ежегодные сметные расходы на детей, связанные с шунтированием, составили в 2003 году 2 миллиарда долларов^США. В то время как дети с шунтами составляют всего 0,6% от общего числа госпитализаций, на них приходится 3,1% расходов на госпитализацию^детей15. Таким образом, открытие безопасных, нехирургических методов лечения ПГПГ имеет первостепенное значение.

У младенцев ПГЖ развивается после ВЖК в течение клинического течения, которое длится от нескольких недель до нескольких месяцев после первоначального выявления кровоизлияния в мозг. Исследование, проведенное Сетью клинических исследований гидроцефалии (HCRN), подтвердило, что VP-шунты остаются лучшим хирургическим вариантом для новорожденных с PHHP¹⁶. Даже для детей с ПГЖ в странах с высоким уровнем дохода, имеющих доступ к квалифицированной педиатрической нейрохирургической помощи, исходы далеки от оптимальных: >50% шунтов, установленных младенцам с ПГГ, требуют хирургической ревизии в течение первых 2 лет⁸. Несмотря на явную необходимость определения более безопасных и эффективных методов лечения ПГПГ, исследования столкнулись с препятствиями. Прогресс был затруднен отчасти потому, что в доклинической литературе по ПГПГ часто не удается должным образом отличить вентрикуломегалию, вызванную гидроцефалией ex vacuo^17,18, от симптоматической гидроцефалии с макроцефалией^19,20. Действительно, модели развития гидроцефалии должны включать прогрессирующую макроцефалию и/или измерения повышенного ВЧД¹.

Объединение клинических и доклинических знаний улучшило дизайн исследования и углубило наше понимание PHHP². Исследования, проведенные в различных центрах по всему миру, показали, что ВЖК наиболее распространена у глубоко недоношенных новорожденных на фоне хориоамнионита 21,22,23,24,25,26,27,28. В дополнение к плацентарной инфекции и воспалению, неонатальный сепсис является дополнительным важным фактором риска и может играть центральную роль в прогрессировании от ВЖК к вентрикуломегалии к симптоматической ПГЖ и последующему хирургическому вмешательству^. Доклинические и клинические данные подтверждают, что воспаление, передающееся через кровь, может вызывать гидроцефалию²⁰, а системное воспаление увеличивает секрецию ликвора сосудистым сплетением³⁰. Кроме того, взрослые с субарахноидальным кровоизлиянием и ВЖК, которые также страдают от сепсиса, гораздо чаще нуждаются в шунте³¹. Более поздняя литература подтвердила, что воспаление снижает эпендимальную подвижность ресничек спинномозговой жидкости ^19,20,32 и реабсорбцию ликвора глимфатической системой 33,34,35,36. В целом, системное воспаление является ключевым патофизиологическим и клиническим фактором при ПГПГ¹.

Учитывая эти результаты, мы создали соответствующую возрасту доклиническую модель ПГПГ. Эта модель сочетает ВЖК в ближайшем и раннем постнатальном периоде с хориоамнионитом, основной причиной преждевременных родов¹⁹. Этот экспериментальный подход начинается внутриутробно, с плацентарной недостаточности, плацентарного воспаления и внутриамниотического воспаления, которые определяют хориоамнионит 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ^,20,21,22,
23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40^,41,42,
43,44,45. В частности, мы повторяем синдром воспалительной реакции плода, плацентарную нейтрофилию и провоспалительное микроокружение ЦНС в недоношенном периоде с помощью абдоминальной лапаротомии у беременных крыс-самок на эмбриональный день 18 (E18)37,38,39,40,41,42,43,44,45. Внутриутробное повреждение индуцируется временной двусторонней окклюзией маточной артерии, приводящей к транзиторной системной гипоксии-ишемии (ТТГ) с последующим внутриамниотическим введением липополисахарида (ЛПС)37,38,39,40,41,42,43,44,45. Впоследствии, чтобы нарушить динамику спинномозговой жидкости и катализировать развитие гидроцефалии у живорожденных детенышей, ВГК индуцируют на 1-й день после рождения. Это достигается с помощью двусторонней интрацеребрвентрикулярной инъекции (ICV) лизированных эритроцитов (эритроцитов) пометника в боковые желудочки 19,37,44. Затем детенышей изучают по мере развития гидроцефалии и на протяжении всей их жизни.

Комитет по уходу за животными и их использованию (ACUC) в Университете Джона Хопкинса одобрил все описанные здесь экспериментальные процедуры. В этом протоколе используются беременные крысы Спрэг-Доули и детеныши обоих полов.

1. Индукция хориоамнионита по Е18

ПРИМЕЧАНИЕ: Часть этого протокола, посвященная оскорблению в утробе матери, была ранее подробно опубликована, кратко изложена выше и является предметом отдельного протокола JOVE и видео 19,37,38,39,40,41,42,43,44,46. Вкратце, беременным самкам крыс Спрэг-Доули проводят абдоминальную лапаротомию на 18-й день эмбриона (E18) для индуцирования хориоамнионита, которая включает TSHI и интраамниотическое введение ЛПС.

1. Анестезия
   1. Индуцировать анестезию у беременной крысы Е18 2-4% изофлураном.
   2. Извлеките беременную мать из индукционной камеры и поместите крысу в лежачем положении на драпированное хирургическое одеяло с циркуляцией воды, установленное при температуре 37 °C.
   3. Применяйте офтальмологическую мазь для предотвращения высыхания роговицы. Аккуратно сожмите лапу, чтобы подтвердить отсутствие рефлекса защемления пальцев ног. Контролируйте глубину анестетика каждые 15-20 минут и увеличивайте дозу изофлурана в случае положительной реакции на защемление пальца ноги.
   4. Вводите бупренорфин в дозе пролонгированного высвобождения (0,1 мг/кг подкожно) в область затылка.
2. Хирургическая подготовка и скрабирование
   1. Используя стандартную стерильную методику, побрейте живот.
   2. Отработайте брюшную полость 3 раза, чередуя бетадин и 70% этанол.
   3. Драпируйте животное с помощью стерильных хирургических простыней.
3. Абдоминальная лапаротомия
   1. Сделайте скальпелем на подготовленной коже живота разрез по средней линии в 3 см.
   2. С помощью щипцов и хирургических ножниц задержите брюшной фасциальный слой и сделайте разрез аваскулярной белой линии мышечного слоя для доступа к брюшной полости.
   3. Экстернализация матки.
   4. Изолируйте и зажмите маточные артерии аневризматическими зажимами на 60 минут. Поддерживайте температуру и поддерживайте внутрибрюшное содержимое во влажном состоянии с помощью стерильного физиологического раствора.
   5. Снимите зажимы и введите по 100 мкл ЛПС (4 мкг/мешок раствора ЛПС) в каждый амниотический мешок каждого плода. Не беспокойте плод или плаценту.
   6. Орошите рога матки и поле щедро 3 раза стерильным физиологическим раствором.
4. Закрытие лапаротомии
   1. Замените маточные рога в брюшной полости.
   2. Подогнайте края мышечно-фасциального слоя и закройте с помощью бегового шва 3-0.
   3. Повторно приблизьте слой кожи и закройте кожу с помощью бегущего шва 3-0.
   4. С помощью иглы 26 G подкожно введите 0,125% бупивакаина по краям раны.
   5. Для фиктивного контроля выполняйте лапаротомию в течение того же периода времени, что и контроль продолжительности анестезии. Не пережимайте артерии и не делайте никаких интраамниотических инъекций. По завершении процедуры закройте лапаротомию в два слоя (фасция мышц живота и кожа) с помощью шва 3-0. Во всех случаях детеныши рождаются в срок (E21/22) и находятся под опекой матери.

2. Получение лизированных эритроцитов на Р1

1. Забор крови
   1. Возьмите одного самца и одну самку крысы Спрэг-Доули в послеродовой день 1 (P1) из помета, в котором был перенесен хориоамнионит на E18. Быстро обезглавливайте каждого донорского щенка с помощью специальных хирургических ножниц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем 1 самца и 1 самку для сбора крови, чтобы устранить потенциальную половую предвзятость, представляя каждого из них в когортах доноров. Кроме того, мы используем пару, соответствующую полу, чтобы гарантировать достаточный объем и выход лизированных эритроцитов для инъекций их однопометникам. Как правило, каждый донорский щенок дает достаточное количество лизированных эритроцитов для проведения инъекции ICV максимум 4-5 однопометникам.
   2. Немедленно соберите кровь в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую 0,2 мл стерильного физиологического раствора, следя за тем, чтобы после обезглавливания собиралась только свободная кровь, а не соскабливая или сжимая для получения большего количества крови, так как это приводит к преждевременному гемолизу. Вихрь хорошо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное количество крови варьируется в зависимости от конкретного донорского животного и веса, но должно быть максимальным при соблюдении вышеуказанных мер предосторожности.
   3. Измельчите/измельчите сгустки крови маленькими хирургическими ножницами.
   4. Центрифугируйте кровяную суспензию при 500 × г в течение 10 мин при 4 ^°С, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Вихрь хорошо.
   5. Измельчите остаточные сгустки крови после вихря маленькими хирургическими ножницами.
   6. Повторите шаги 2.1.4-2.1.5 еще дважды, в общей сложности 3 раза, очищая хирургические ножницы спреем с 70% этанолом между каждым раундом лизинга.
2. Лизис эритроцитов
   1. После окончательного центрифугирования добавьте в гранулу 0,25 мл стерильного физиологического раствора; вихревой колодец.
   2. Поместите суспензию на сухой лед на 5 минут.
   3. Извлеките суспензию из сухого льда, поместите ее в инкубатор, установленный при температуре 37,5 ^оС, на 5 мин до полного оттаивания, и хорошо протрите вихрь.
   4. Повторите циклы замораживания и размораживания в общей сложности 3 раза (три заморозки и три оттаивания).
   5. По завершении последней оттепели сделайте вихрь и выполните быстрый спин. Эритроциты теперь лизированы и готовы к использованию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь должна быть непрозрачного цвета, похожего на томатный сок, и легко набираться в шприцы.

3. Внутримозговые инъекции лизированных эритроцитов на Р1

1. Обезболивание с помощью гипотермии
   1. Поставьте небольшую платформу на мокрый лед для охлаждения.
   2. Положите сверху сухую лабораторную салфетку, чтобы защитить кожу щенка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта плоская холодная поверхность используется для обезболивания и инъекций щенкам.
   3. Переложите щенка (в возрасте P1) с грелки на рабочую салфетку на холодной платформе, чтобы вызвать анестезию путем гипотермии.
   4. Подтвердите глубину анестезии сдавливанием лапы и подтвердите отсутствие рефлекса защемления пальца ноги.
   5. Установите внешнюю хирургическую лампу на самые яркие настройки.
   6. С помощью помощника, используя указательный и средний пальцы, чтобы мягко поддерживать среднюю линию головы животного, просвечивайте череп, чтобы визуализировать боковые желудочки через череп. Определите брегму путем визуализации верхнего сагиттального синуса (средней линии) через кожу и пальпации коронального шва с помощью тонких щипцов в качестве пересекающихся ориентиров.
2. Инъекция ICV
   1. Протрите голову обезболенного щенка ватным тампоном, смоченным в 70% этаноле.
   2. Определите и отметьте место инъекции как боковое на 1 мм от сагиттального шва, на полпути между лямбдой и брегмой.
   3. После визуализации с помощью инсулинового шприца длиной 8 мм 31 г объемом 0,3 мл с ультратонкой чрескожной иглой введите 20 мкл лизированных эритроцитов в правый боковой желудочек. Введите иглу прямо вниз, используя технику свободной руки, на глубину примерно половины длины иглы и медленно вводите и извлекайте иглу (процесс инъекции и извлечения занимает примерно 10-15 секунд).
   4. Оставьте иглу на месте на несколько секунд после инъекции, чтобы предотвратить выход введенных лизированных эритроцитов.
   5. Повторите то же самое с левым боковым желудочком и введите 20 мкл лизированных эритроцитов.
   6. Положите щенка на грелку, установленную при температуре 37,5 ^°C, чтобы восстановиться после анестезии.
   7. Запишите пол щенка и присвойте уникальный идентификатор животного.
   8. Возвращайте щенка в домашнюю клетку только после полного выздоровления на грелке и прихода в сознание таким образом, чтобы животное могло безопасно сохранять лежачее положение на грудине.
   9. Ежедневно следите за здоровьем и благополучием всех крысят.

4. Подтверждение успешного двустороннего внутрижелудочкового кровоизлияния на Р2

1. УЗИ головы
   1. Чтобы подготовиться к УЗИ головы, извлеките щенков P2 из домашней клетки.
   2. Нанесите ультразвуковой гель на ультразвуковой зонд и расположите зонд над верхней частью черепа.
   3. При очень легком давлении переместите зонд для визуализации желудочков. Подтвердить двустороннюю гиперэхогенность в боковых желудочках, представляющих ВЖК.

5. Подтверждение успешной постгеморрагической гидроцефалии

1. Измерение внутриушного расстояния (IAD), суррогата окружности головы, для подтверждения макроцефалии
   1. Чтобы подготовиться к измерению, приобретите небольшую рулетку, подходящую для измерения окружности головы, в идеале с четко визуализированными миллиметровыми обозначениями.
   2. Попросите наблюдателя в маске забрать щенка из домашней клетки.
   3. Осторожно держа щенка, измерьте расстояние от уха до уха (внутриушное расстояние, IAD) и запишите значение в миллиметрах.
   4. Повторяйте IAD ежедневно от P1 до P15 и стройте графики значений. Последовательное отслеживание IAD и повторное измерение на уровне P21 при перемещении щенков в новые клетки, физически отделенные от матери (что является стандартным моментом времени для отъема щенков). Повторяйте IAD каждые 5 дней, начиная с P25 до P60.
2. Измерение давления раскрытия для подтверждения повышенного внутричерепного давления
   1. Попросите наблюдателя в маске вытащить щенка из домашней клетки.
   2. Обезболивайте 75-100 мг/кг внутрибрюшинного кетамина (ВП) и 5-10 мг/кг ВП ксилазина при подготовке к эвтаназии.
   3. Проверьте глубину анестезии, сдавливая лапу и подтверждая отсутствие рефлекса защемления пальца ноги/педали.
   4. Вставьте маленькую иглу (31 G), соединенную с манометром, в пространство цервикомедуллярного перехода спинномозговой жидкости.
   5. Запишите давление открытия на манометре.
   6. Извлеките иглу и обезглавьте крысу острыми ножницами и приступайте к сбору тканей.
3. Магнитно-резонансная томография (МРТ) ex-vivo для оценки вентрикуломегалии
   1. Обезболивайте 75-100 мг/кг внутрибрюшинным (IP) кетамином и 5-10 мг/кг IP-ксилазином при подготовке к эвтаназии.
   2. Проверьте глубину анестезии, сдавливая лапу и подтверждая отсутствие рефлекса защемления пальца ноги/педали.
   3. Перфузируйте крыс фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем 4% параформальдегидом (PFA) до тех пор, пока они хорошо не затвердеют.
   4. Удалите мозг и зафиксируйте его в 4% PFA
   5. Встройте мозг в 2% агарозу в коническую трубку объемом 50 мл. Дайте постоять при комнатной температуре.
   6. Перенесите мозг в МРТ-сканер для проведения МРТ ex vivo .
   7. Проведите МРТ 11,7 Тл следующим образом: T2 Turbo RARE; TE/TR = 30,0/3000 мс; среднее = 2; Расстояние между эхо-сигналами = 10 000 мс; РЕДКИЙ ФАКТОР = 8; количество срезов = 30; толщина ломтика = 1 мм; размер изображения = 128 x 128; FOV = 28 мм x 28 мм; разрешение среза = 0,219 x 0,219 мм²; FA = 90,0°.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что МРТ является доказательством успешного моделирования ПГПГ, для проверки ПГП не требуется сканирование всех видов мозга в данной когорте. Измерения IAM и ICP достаточно для проверки, как описано выше. В конечном счете, способность исследователя выполнять МРТ in vivo или ex vivo будет зависеть от множества факторов, таких как доступ к МРТ-сканеру, средства и технические возможности. Этот шаг особенно полезен для валидации при новом внедрении модели PHHP. Важно отметить, что при отсутствии документально подтвержденных признаков повышенного внутричерепного давления, таких как повышенное давление вскрытия, единичные признаки вентрикуломегалии на МРТ не представляют собой гидроцефалию.

При использовании этой модели гидроцефалия развивается в течение нескольких дней и недель после введения лизированных эритроцитов. Представление типичного плана эксперимента и прогрессирования гидроцефалии представлено на рисунке 1. Мы оценивали 5-...

Этот протокол для индукции ПГГП позволяет проводить строгие, поддающиеся количественной оценке и клинически переводимые критерии структуры и функции мозга в сочетании с фенотипическими признаками гидроцефалии, включая хроническое повышение ВЧД, вентрикуломегалию...

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Авторы благодарны за финансирование, предоставленное Национальными институтами здравоохранения (R01HL139492), Программой медицинских исследований под руководством Конгресса (W81XWH1810166, W81XWH1810167, W81XWH2210461 и W81XWH2210462), Ассоциацией гидроцефалии и Научно-исследовательским институтом Руди Шульте.