신생아 쥐에서 출혈후 미숙수두증(PHHP)을 융모양막염과 뇌실내 출혈을 결합하여 모델링할 수 있습니다. 이러한 산전 및 산후 사건의 조합은 대두증, 심실 비대증 및 두개내압 상승을 포함한 PHP의 임상적 특징을 수명 전반에 걸쳐 정확하게 요약합니다.

출혈후 미숙아수두증(PHHP)은 재태 연령(GA)이 32주 미만인 초미숙아에서 발생하는 중증 뇌실내 출혈(IVH)의 심각한 후유증입니다. PHHP는 두개내압(ICP) 상승의 임상 증상과 관련된 뇌척수액(CSF)의 축적으로 정의됩니다. HHP를 앓고 있는 영아는 평생 션트 의존증을 앓고 있으며, 절반은 생후 1년 이내에 재수술이 필요하고 많은 경우 평생 동안 여러 번의 추가 수술이 필요합니다. 산전 융모막염은 미숙아를 중증 IVH에 걸리게 하고 HHP의 외과적 치료가 필요한 경우 신생아 패혈증이 발생하는 경향이 있습니다. 이러한 임상적 특징은 전신 염증이 PHHP 병태생리학의 필수 구성 요소임을 시사합니다.

여기에서는 쥐에서 PHHP의 모든 임상적 측면과 필수 기능을 요약한 동물 모델을 정의합니다. 이 프로토콜의 목표는 자궁 융모양막염과 산후 IVH에서 용해된 적혈구를 사용하여 HHP를 생성하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 전임상 접근법은 진행성 대두증 및 돔형 두개골, 두개내 압력 상승 및 뇌실 비대증을 산출하며, 이는 자기 공명 영상(MRI) 또는 현미경을 통해 감지할 수 있습니다. 뇌척수액 역학의 지속적인 방해 외에도 쥐는 성인이 될 때까지 인지 지연과 기능 장애를 가지고 있습니다. 따라서 이 전임상 플랫폼은 분자, 세포, 생화학, 조직학적, 이미징 및 기능적 결과 측정을 통합할 수 있는 PHHP의 독특하고 비교할 수 없는 중개 연구를 촉진합니다. 또한 맥락막신경총(choroid plexus), 뇌실막운동성(ependymal motile cilia) 및 글림프계(glymphatic system)를 병렬로 엄격하게 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 수두증 치료를 위한 새로운 외과적 중재 전략 및 비수술적 치료 접근법을 조사하기 위한 귀중한 전임상 도구가 될 수도 있습니다.

출혈 후 미숙수두증(PHHP)은 여전히 상당한 공중 보건 문제로 남아 있습니다. 뇌실내 출혈(IVH)에 이차적으로 발생하는 두개내압(ICP) 상승과 함께 뇌척수액(CSF)의 증상 축적으로 정의되는 PHHP는 미숙아 뇌병증의 심각한 징후이며 전 세계 조산 및 후천성 수두증 ^1,2의 부담에 크게 기여합니다. 전 세계적으로 매년 약 400,000명의 신생아가 수두증을 앓거나 평생 앓게 되며3 많은 수가 치료 부족으로 인해 사망합니다³. PHHP는 선진국에서 중증 IVH를 가진 미숙아(임신 <32주)에서 흔하게 발생하며, 이미 생명을 위협하는 다른 동반 질환을 앓고 있는 가장 아픈 영아에게 영향을 미치는 경우가 많습니다 ^4,5.

수두증에 사용할 수 있는 유일한 치료법은 수술이다⁶. 뇌척수액을 전환하기 위한 심실복막(VP) 션트(CSF), 내시경 제3뇌실절개술(ETV) 또는 맥락막신경총 응고를 동반한 ETV(ETV-CPC)에 관계없이, 첫 번째 영구 중재 시점에 영아가 6개월 이상일 때 수술 절차가 더 오래 지속됩니다⁷. 가장 흔한 옵션인 VP 션트는 종종 1년 이내에 실패하고 어린이를 평생 합병증, 반복 수술 및 입원에 노출시켜 어린이, 가족 및 사회에 막대한 비용을 초래합니다. ⁸ 특히, 언제라도 실패할 수 있는 션트(shunt)로 인한 불안은 가족에게 부담이 된다⁹. 잦은 수술을 포함하여 증상이 있는 수두증이 있는 소아를 돌보는 것은 소아과 의료 지출의 주요 원인입니다 10,11,12,13,14. 2003년 아동의 션트 관련 지출로 인한 연간 추정 비용은 20억 달러였다¹⁵. 션트가 있는 어린이는 입원 환자의 0.6%에 불과하지만 소아과 병원 비용의 3.1%를 발생시킵니다¹⁵. 따라서 PHHP 치료를 위한 안전한 비수술적 치료법을 발견하는 것이 가장 중요합니다.

영아의 경우, PHHP는 뇌출혈이 처음 확인된 후 몇 주에서 몇 달 동안 지속되는 임상 기간 경과에 걸쳐 IVH 이후 발생합니다. HCRN(Hydrocephalus Clinical Research Network)에서 실시한 연구에 따르면 VP 션트는 PHHP¹⁶을 가진 신생아에게 가장 좋은 수술 옵션으로 남아 있습니다. 숙련된 소아 신경외과 치료를 받을 수 있는 고소득 국가의 HHP를 앓고 있는 소아의 경우에도 결과는 최적과는 거리가 멀어서, HHP를 가진 영아에게 삽입된 션트의 >50%가 첫 2년 이내에 외과적 재수술이 필요하다⁸. HHP에 대한 더 안전하고 효과적인 치료법을 찾아야 할 분명한 필요성에도 불구하고 연구는 장애물에 직면해 있습니다. HHP에 대한 전임상 문헌이 종종 공수수종(hydrocephalus ex vacuo) ^17,18에 의해 유발되는 뇌실비대와 대두증(macrocephaly)^19,20을 동반한 증상이 있는 수두증을 적절하게 구별하지 못하기 때문에 진전이 방해를 받고 있습니다. 실제로, 수두증의 발달 모델에는 진행성 대두증 및/또는 ICP 상승 측정이 포함되어야 한다¹.

임상 및 전임상 통찰력을 통합함으로써 연구 설계가 개선되고 PHHP²에 대한 이해가 촉진되었습니다. 전 세계 다양한 센터에서 수행된 연구에 따르면 IVH는 융모양막염 21,22,23,24,25,26,27,28에 이차적으로 발생하는 매우 조산한 신생아에서 가장 흔합니다. 태반 감염 및 염증 외에도 신생아 패혈증은 또 다른 중요한 위험 인자이며, IVH에서 심실비대증, 증상이 있는 PHHP로 진행되고 그에 따른 외과적 개입에 중심적인 역할을 할 수 있다²⁹. 전임상 및 임상 데이터는 혈액 매개 염증이 수두증²⁰을 유발할 수 있으며, 전신 염증이 맥락막신경총³⁰에 의한 CSF 분비를 증가시킨다는 것을 뒷받침합니다. 또한, 지주막하 출혈 및 IVH가 있는 성인과 패혈증을 앓고 있는 성인은 션트가 필요할 가능성이 훨씬 더 높다³¹. 보다 최근의 문헌에서는 염증이 CSF ^19,20,32의 뇌실막운동성 섬모 추진력을 감소시키고 글림프계에 의한 CSF 재흡수를 감소시키는 것으로 확인되었습니다 33,34,35,36. 전반적으로, 전신 염증은 PHHP¹의 주요 병태생리학적 및 임상적 동인입니다.

이러한 결과를 고려하여 연령에 적합한 HHP의 전임상 모델을 만들었습니다. 이 모델은 출생 직후 및 출생 초기의 IVH와 조산의 주요 원인인 융모양염을 결합한 것이다¹⁹. 이 실험적 접근법은 자궁에서 태반 기능 부전, 태반 염증 및 양수 내 염증으로 시작하여 융모막염 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 를 정의합니다 ^,20,21,22,
23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40^,41,42,
43,44,45입니다. 구체적으로, 배아 18일 임신한 쥐댐에서 복부 개복술을 통해 태아 염증 반응 증후군, 태반 호중구증가증, 전염증성 중추신경계 미세환경을 조산으로 요약한다 (E18)37,38,39,40,41,42,43,44,45. 자궁 내 손상은 일시적인 양측 자궁 동맥 폐색에 의해 유발되어 일시적인 전신 저산소증-허혈(TSHI)을 일으킨 후 양수 내 주사로 지질다당류(LPS)를 주사합니다37,38,39,40,41,42,43,44,45. 그 후, CSF 역학을 교란하고 살아있는 새끼의 수두증 발달을 촉진하기 위해 IVH는 출생 후 1일차에 유도됩니다. 이것은 외측심실로 연안 용해된 적혈구(RBC)의 양측 기관내복실 주사(ICV)로 이루어집니다 19,37,44. 그런 다음 새끼는 수두증이 발달하고 평생 동안 연구됩니다.

존스 홉킨스 대학의 동물 관리 및 사용 위원회(ACUC)는 여기에 설명된 모든 실험 절차를 승인했습니다. 이 프로토콜은 임신한 Sprague-Dawley 쥐댐과 암수 모두의 새끼를 활용합니다.

1. E18에 융모양막염 유도

참고: 이 프로토콜의 자궁 내 모욕 부분은 이전에 자세히 게시되었으며 위에 요약되어 있으며 별도의 JOVE 프로토콜 및 비디오 19,37,38,39,40,41,42,43,44,46의 주제입니다.. 간단히 말해서, 임신한 암컷 Sprague-Dawley 쥐는 배아 18일(E18)에 TSHI 및 양수 내 LPS 투여를 포함하는 융모양염을 유발하기 위해 복부 개복술을 받습니다.

1. 마취
   1. E18 임신 랫드 댐에서 2-4% 이소플루란으로 마취를 유도합니다.
   2. 인덕션 챔버에서 임산부의 댐을 제거하고 37°C로 설정된 드레이프된 수술용 순환수 담요에 쥐를 누운 자세로 놓습니다.
   3. 각막 건조를 방지하기 위해 안과 연고를 바르십시오. 발가락 핀치 반사가 없는지 확인하기 위해 발을 부드럽게 쥐십시오. 15-20분마다 마취 깊이를 모니터링하고 발가락 꼬집음 반응이 양성인 경우 이소플루란을 증가시킵니다.
   4. 목덜미에 부프레노르핀 서방형(0.1mg/kg SC)을 투여합니다.
2. 수술 준비 및 스크럽
   1. 표준 멸균 기술을 사용하여 복부를 면도하십시오.
   2. 베타딘과 70% 에탄올을 번갈아 가며 복부를 3번 문지릅니다.
   3. 멸균 수술용 드레이프를 사용하여 동물을 드레이핑합니다.
3. 복부 개복술
   1. 준비된 복부 피부를 메스로 3cm 정도 정중하게 절개합니다.
   2. 집게와 수술용 가위를 사용하여 복부 근막층을 지지하고 근육층의 무혈관 선알바를 절개하여 복막강에 접근합니다.
   3. 자궁을 외부화합니다.
   4. 동맥류 클립으로 자궁 동맥을 분리하고 60분 동안 고정합니다. 온도를 유지하고 멸균 식염수로 복강 내 내용물을 촉촉하게 유지하십시오.
   5. 클립을 제거하고 각 태아의 각 양막에 100μL의 LPS(4μg/sac의 LPS 용액)를 주입합니다. 태아나 태반을 건드리지 마십시오.
   6. 자궁 뿔에 관개를 주고 멸균 식염수를 3배 넉넉하게 밭에 덧대십시오.
4. 개복술 닫기
   1. 복막강에 있는 자궁 뿔을 교체합니다.
   2. 근막층 가장자리를 다시 근사치하고 Running 3-0 봉합사를 사용하여 닫습니다.
   3. 피부층을 다시 근사화하고 러닝 3-0 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다.
   4. 26G 바늘을 사용하여 상처 가장자리 주위에 0.125% 부피바카인을 피하 주사합니다.
   5. 가짜 대조군의 경우, 마취 기간 동안 통제하기 위해 동일한 시간 동안 개복술을 수행합니다. 동맥을 조이지 말고 양수 주사를 투여하지 마십시오. 시술이 끝나면 3-0 봉합사를 사용하여 두 층(복부 근육 근막과 피부)으로 개복술을 닫습니다. 모든 경우에 새끼는 만삭(E21/22)에 태어나 댐에서 보살핌을 받습니다.

2. P1에 용해된 적혈구의 준비

1. 혈액 채취
   1. E18에서 융모양막염을 앓은 새끼로부터 출생 후 1일차(P1)에 수컷 Sprague-Dawley 새끼 한 마리와 암컷 한 마리를 데려갑니다. 전용 수술 가위로 각 기증자 강아지의 목을 빠르게 베십시오.
      참고: 우리는 헌혈자 코호트에서 각각을 대표하여 잠재적인 성별 편견을 제거하기 위해 혈액 수집을 위해 1마리의 수컷 강아지와 1마리의 암컷 강아지를 사용합니다. 또한, 당사는 성별이 일치하는 쌍을 사용하여 용해된 적혈구를 주입하기에 충분한 부피와 수율을 보장합니다. 일반적으로 각 기증자 새끼는 최대 4-5마리의 새끼에게 ICV 주사를 수행할 수 있을 만큼 충분한 용해된 적혈구를 생성합니다.
   2. 0.2mL의 멸균 식염수가 들어 있는 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 혈액을 즉시 수집하고, 참수 후 자유롭게 흐르는 혈액만 수집하도록 주의하고 조기 용혈을 유발할 수 있으므로 더 많은 혈액을 생성하기 위해 긁거나 짜지 않도록 주의하십시오. 소용돌이 잘.
      참고: 정확한 혈액의 양은 개별 기증자, 동물 및 체중에 따라 다르지만 위의 예방 조치를 유지하면서 최대가 되어야 합니다.
   3. 작은 수술용 가위로 혈전을 자르거나 다집니다.
   4. 혈액 현탁액을 500 × g 에서 4 ^°C에서 10 분 동안 원심 분리하고, 상층액을 제거하고, 펠릿을 0.2 mL의 멸균 식염수에 재현탁시킨다. 소용돌이 잘.
   5. 작은 수술 용 가위로 와류 잔류 혈전을 자르거나 다집니다.
   6. 2.1.4-2.1.5 단계를 두 번 더 반복하여 총 3 회 반복하고 각 용해 라운드 사이에 70 % 에탄올 스프레이로 수술 용 가위를 청소합니다.
2. 적혈구의 용해
   1. 최종 원심분리 후, 펠릿에 0.25mL의 멸균 식염수를 첨가합니다. 소용돌이 글쎄.
   2. 서스펜션을 드라이아이스에 5분 동안 놓습니다.
   3. 드라이 아이스에서 현탁액을 제거하고 완전히 해동 될 때까지 37.5 ^°C로 설정된 인큐베이터에 5 분 동안 놓고 잘 소용돌이칩니다.
   4. 총 3회(3회 동결 및 3회 동결)에 대해 동결 및 해동 주기를 반복합니다.
   5. 마지막 해동이 끝나면 소용돌이를 일으키고 빠른 회전을 수행합니다. 이제 적혈구가 용해되어 사용할 준비가 되었습니다.
      참고: 혼합물은 불투명한 토마토 주스와 같은 색상이어야 하며 주사기에 쉽게 빨려 들어갈 수 있어야 합니다.

3. P1에 용해된 적혈구의 Intracerebrovenular 주사

1. 저체온증을 이용한 마취
   1. 젖은 얼음 위에 작은 플랫폼을 놓아 식히십시오.
   2. 강아지의 피부를 보호하기 위해 마른 실험실 물티슈를 위에 놓습니다.
      참고: 이 평평하고 차가운 표면은 강아지를 마취하고 주입하는 데 사용됩니다.
   3. 온난화 패드에서 강아지(P1세)를 저체온증으로 마취시키기 위해 차가운 플랫폼 위의 작업 물티슈로 옮깁니다.
   4. 발을 쥐어 마취 깊이를 확인하고 발가락 핀치 반사가 없는지 확인합니다.
   5. 외부 수술용 램프를 가장 밝은 설정으로 설정합니다.
   6. 조수가 검지와 중지를 사용하여 동물의 머리 정중선을 부드럽게 유지하고 두개골을 트랜스라이트화하여 두개골을 통한 측면 심실을 시각화합니다. 관상 봉합사의 피부와 촉진을 통해 상시상동(정중선)을 교차하는 랜드마크로 미세한 집게로 시각화하여 브레그마를 식별합니다.
2. ICV 주사
   1. 마취된 강아지의 머리를 70% 에탄올에 적신 면봉으로 닦습니다.
   2. 주사 부위를 시상 봉합사에서 1mm 측면, 람다와 브레그마의 중간으로 식별하고 표시합니다.
   3. 시각화 후 0.3mL, 길이 8mm, 31G 인슐린 주사기와 초미세 경피 바늘을 사용하여 용해된 적혈구 20μL를 우측 측심실에 주입합니다. 자유형 기술을 사용하여 바늘 길이의 약 절반 깊이까지 바늘을 똑바로 아래쪽으로 삽입하고 바늘을 천천히 주입 및 제거합니다(약 10-15초에 걸쳐 주입 및 제거 과정).
   4. 주입된 용해된 적혈구의 배출을 방지하기 위해 주입 후 몇 초 동안 바늘을 제자리에 두십시오.
   5. 좌측 심실에 대해 반복하고 용해된 적혈구 20μL를 주입합니다.
   6. 마취에서 회복하기 위해 37.5 ^°C로설정된 보온 패드에 강아지를 놓습니다.
   7. 강아지의 성별을 기록하고 고유한 동물 식별자를 할당합니다.
   8. 동물이 흉골 누운 상태를 안전하게 유지할 수 있도록 온난화 패드에서 완전히 회복되고 의식을 회복한 후에만 강아지를 가정용 케이지로 되돌려 보내야 합니다.
   9. 건강과 웰빙을 위해 모든 새끼 쥐를 매일 모니터링하십시오.

4. P2에서 성공적인 양측 뇌실내 출혈 확인

1. 두부 초음파
   1. 머리 초음파를 준비하기 위해 P2 강아지를 집 케이지에서 제거하십시오.
   2. 초음파 프로브에 초음파 젤을 놓고 프로브를 두개골 상단에 놓습니다.
   3. 매우 가벼운 압력으로 프로브를 움직여 심실을 시각화합니다. IVH를 나타내는 외측심실에서 양측 과음향성을 확인합니다.

5. 성공적인 posthemorrhagic hydrocephalus의 확인

1. 대두증을 확인하기 위해 머리 둘레를 대리하는 귀 내 거리(IAD)를 측정합니다.
   1. 측정을 준비하려면 머리 둘레를 측정하는 데 적합한 작은 줄자를 구해야 하며, 이상적으로는 명확하게 시각화된 밀리미터 표시가 있어야 합니다.
   2. 마스크를 쓴 관찰자가 집 우리에서 강아지를 제거하도록 합니다.
   3. 강아지를 부드럽게 안고 귀에서 귀까지의 거리(귀 내 거리, IAD)를 측정하고 값을 밀리미터 단위로 기록합니다.
   4. P1에서 P15까지 매일 IAD를 반복하고 값을 그래프로 표시합니다. IAD를 직렬로 추적하고 댐에서 물리적으로 분리된 새 케이지(강아지 젖을 떼는 표준 시점)로 강아지를 재배치할 때 P21에서 다시 측정합니다. 이후 P25부터 P60까지 5일마다 IAD를 반복합니다.
2. 상승된 두개내 압력을 확인하기 위한 개방 압력 측정
   1. 마스크를 쓴 관찰자가 집 우리에서 강아지를 꺼내게 합니다.
   2. 안락사를 준비하기 위해 75-100mg/kg의 복강내(IP) 케타민과 5-10mg/kg IP 자일라진으로 마취합니다.
   3. 발을 쥐어 마취 깊이를 확인하고 발가락 꼬집음/페달 반사가 없는지 확인합니다.
   4. 압력계에 연결된 작은 바늘(31G)을 경추 접합부 CSF 공간에 삽입합니다.
   5. 압력계의 개방 압력을 기록하십시오.
   6. 바늘을 제거하고 날카로운 가위로 쥐의 목을 베고 조직 채취를 진행하십시오.
3. 심실비대증 평가를 위한 체외자기공명영상(Ex-vivo magnetic resonance imaging, MRI)
   1. 안락사를 준비하기 위해 75-100mg/kg의 복강내(IP) 케타민과 5-10mg/kg IP 자일라진으로 마취합니다.
   2. 발을 쥐어 마취 깊이를 확인하고 발가락 꼬집음/페달 반사가 없는지 확인합니다.
   3. 쥐에게 인산염 완충 식염수(PBS)를 관류한 다음 잘 고정될 때까지 4% 파라포름알데히드(PFA)를 투여합니다.
   4. 뇌를 제거하고 뇌를 4% PFA로 떨어뜨립니다.
   5. 50mL 원뿔형 튜브에 2% 아가로스에 뇌를 삽입합니다. 실온에 두십시오.
   6. 생체 외 MRI를 위해 뇌를 MRI 스캐너로 이식합니다.
   7. 11.7T MRI 실행: T2 터보 RARE; TE/TR = 30.0/3000밀리초; 평균 = 2; 에코 간격 = 10.000ms; 희귀 요소 = 8; 슬라이스 수 = 30; 슬라이스 두께 = 1mm; 이미지 크기 = 128 x 128; 시야각 = 28mm x 28mm; 슬라이스 해상도 = 0.219 x 0.219 mm²; FA = 90.0°입니다.
      참고: MRI 영상은 성공적인 PHHP 모델링의 증거를 제공하지만 PHHP를 확인하기 위해 주어진 코호트의 모든 뇌를 스캔할 필요는 없습니다. IAM 및 ICP 측정은 위에서 설명한 대로 확인하기에 충분합니다. 궁극적으로 시험관이 생체 내 또는 생체 외 MRI를 수행할 수 있는 능력은 MRI 스캐너 접근성, 자금 및 기술적 능력과 같은 다양한 요인에 따라 달라집니다. 이 단계는 PHHP 모델을 새로 통합할 때 검증에 특히 유용합니다. 개방 압력 상승과 같은 두개내압 증가에 대한 문서화된 징후가 없는 경우, MRI 영상에서 고립된 심실 비대증 소견이 수두증을 나타내 지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

이 모델을 사용하면 용해된 적혈구를 주입한 후 며칠 및 몇 주 후에 수두증이 발생합니다. 수두증의 일반적인 실험 설계 및 진행에 대한 표현이 그림 1에 나와 있습니다. 그룹당 5-6마리의 가짜 동물과 6-8마리의 PHHP 동물을 평가했습니다. 청소년 시절에 PHP를 가진 쥐는 대두증(그림 2), 두개내 압력 상승(그림 3

PHHP 유도를 위한 이 프로토콜은 출생부터 성인기까지 ICP, 심실비대, 대두증의 만성 상승을 포함하여 수두증의 표현형 특징과 수반되는 뇌 구조 및 기능에 대한 엄격하고 정량화할 수 있으며 임상적으로 번역 가능한 결과 측정을 가능하게 합니다⁴. 생화학적, 조직학적, 기능적 분석법은 맥락막신경총(choroid plexus), 뇌실막(ependyma), 글림프계(glymphatic system)뿐...

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

저자들은 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R01HL139492), 의회 주도 의학 연구 프로그램(Congressionally Directed Medical Research Program, W81XWH1810166, W81XWH1810167, W81XWH2210461, W81XWH2210462), 수두증 협회(Hydrocephalus Association), 루디 슐테 연구소(Rudi Schulte Research Institute)가 제공한 기금에 감사한다.