Modélisation de l’hydrocéphalie posthémorragique de la prématurité chez le rat

L’hydrocéphalie posthémorragique du prématuré (PHHP) peut être modélisée chez le rat nouveau-né en associant la chorioamnionite et l’hémorragie intraventriculaire. La combinaison de ces événements prénataux et postnatals récapitule avec précision les caractéristiques cliniques du PHHP, notamment la macrocéphalie, la ventriculomégalie et l’élévation de la pression intracrânienne, tout au long de la vie.

L’hydrocéphalie posthémorragique du prématuré (PHHP) est une séquelle grave d’une hémorragie intraventriculaire (IVH) sévère chez les grands prématurés de moins de 32 semaines d’âge gestationnel (AG). La PHHP est définie par l’accumulation de liquide céphalo-rachidien (LCR) associée à des symptômes cliniques d’élévation de la pression intracrânienne (PIC). Les nourrissons atteints de PHHP souffrent d’une dépendance à vie à la dérivation, la moitié nécessitant une intervention chirurgicale répétée au cours de la première année de vie et beaucoup nécessitant plusieurs interventions chirurgicales supplémentaires tout au long de la vie. La chorioamnionite prénatale prédispose les nouveau-nés prématurés à une hémorragie intraveineuse sévère et à la nécessité d’un traitement chirurgical des tendances PHHP avec septicémie néonatale. Ces caractéristiques cliniques suggèrent que l’inflammation systémique fait partie intégrante de la physiopathologie du PHHP.

Ici, nous définissons un modèle animal qui récapitule tous les aspects cliniques et les caractéristiques essentielles de la PHHP chez le rat. L’objectif de ce protocole est d’illustrer comment la chorioamnionite in utero et l’HVI postnatale à l’aide de globules rouges lysés peuvent être combinées pour produire des PHHP. Cette approche préclinique permet d’obtenir une macrocéphalie progressive et des crânes bombés, une pression intracrânienne élevée et une ventriculomégalie qui peuvent être détectées par imagerie par résonance magnétique (IRM) ou par microscopie. En plus d’une perturbation soutenue de la dynamique du LCR, les rats présentent également un retard cognitif et une incapacité fonctionnelle à l’âge adulte. En conséquence, cette plateforme préclinique facilite des études translationnelles uniques et inégalées sur le PHHP qui peuvent intégrer des mesures moléculaires, cellulaires, biochimiques, histologiques, d’imagerie et de résultats fonctionnels. Il peut également être utilisé pour une analyse rigoureuse du plexus choroïde, des cils mobiles épendymaires et du système glymphatique en parallèle. Enfin, il peut également s’agir d’un outil préclinique inestimable pour l’étude de nouvelles stratégies d’intervention chirurgicale et d’approches thérapeutiques non chirurgicales pour le traitement de l’hydrocéphalie.

L’hydrocéphalie posthémorragique du prématuré (PHHP) reste un problème de santé publique important. Définie par une accumulation symptomatique de liquide céphalo-rachidien (LCR) concomitante à une pression intracrânienne élevée (PIC) secondaire à une hémorragie intraventriculaire (HIV), la PHHP est une manifestation grave de l’encéphalopathie du prématuré et contribue de manière significative au fardeau mondial de la prématurité et de l’hydrocéphalie acquise ^1,2. À l’échelle mondiale, environ 400 000 nourrissons naissent chaque année avec ou acquièrent le fardeau de l’hydrocéphalie³ à vie et beaucoup meurent en raison de l’absence de traitement³. La PHHP est fréquente dans les pays développés chez les grands prématurés (<32 semaines de gestation) atteints d’hémorragie intraveineuse sévère, et touche souvent les nourrissons les plus malades qui souffrent déjà d’autres comorbidités potentiellement mortelles ^4,5.

Le seul traitement disponible pour l’hydrocéphalie est la chirurgie⁶. Les interventions chirurgicales permettent une meilleure longévité lorsque les nourrissons ont plus de 6 mois au moment de la première intervention permanente, qu’il s’agisse d’une dérivation ventriculo-péritonéale (VP) pour détourner le liquide céphalo-rachidien (LCR), d’une troisième ventriculostomie endoscopique (VTE) ou d’une VTE avec coagulation du plexus choroïde (VTE-CPC)⁷. L’option la plus courante, les dérivations VP, échoue souvent dans l’année et prédispose les enfants à toute une vie de complications, de chirurgies répétées et d’hospitalisations, ce qui coûte cher à l’enfant, à la famille et à la société. ⁸ En particulier, l’anxiété liée à une dérivation susceptible d’échouer à tout moment est pesante pour les familles⁹. Les soins aux enfants atteints d’hydrocéphalie symptomatique, y compris les interventions chirurgicales fréquentes, sont l’une des principales causes de dépenses de santé pédiatrique 10,11,12,13,14. Le coût annuel estimé des dépenses liées aux dérivations chez les enfants était de 2 milliards de dollars en 2003¹⁵. Alors que les enfants atteints de dérivation ne représentent que 0,6 % des admissions à l’hôpital, ils génèrent 3,1 % des frais hospitaliers pédiatriques¹⁵. Ainsi, la découverte de thérapies sûres et non chirurgicales pour le traitement du PHHP est primordiale.

Chez les nourrissons, la PHHP se développe après une hémorragie intraveineuse au cours d’une période clinique qui dure des semaines à des mois après l’identification initiale de l’hémorragie cérébrale. Une étude menée par le Réseau de recherche clinique sur l’hydrocéphalie (HCRN) a confirmé que les dérivations VP restent la meilleure option chirurgicale pour les nouveau-nés atteints de PHHP¹⁶. Même pour les enfants atteints de PHHP dans les pays à revenu élevé ayant accès à des soins neurochirurgicaux pédiatriques qualifiés, les résultats sont loin d’être optimaux, avec >50 % des shunts placés chez les nourrissons atteints de PHHP nécessitant une révision chirurgicale au cours des 2 premières années⁸. Malgré le besoin évident d’identifier des traitements plus sûrs et plus efficaces pour les PHHP, la recherche s’est heurtée à des obstacles. Les progrès ont été entravés en partie parce que la littérature préclinique sur la PHHP ne parvient souvent pas à distinguer correctement la ventriculomégalie causée par l’hydrocéphalie ex vacuo ^17,18 de l’hydrocéphalie symptomatique avec macrocéphalie^19,20. En effet, les modèles développementaux de l’hydrocéphalie devraient inclure une macrocéphalie progressive et/ou des mesures d’une ICP¹ élevée.

La fusion des connaissances cliniques et précliniques a amélioré la conception de l’étude et propulsé notre compréhension de PHHP². Des études menées dans divers centres à travers le monde ont montré que l’HVI est plus fréquente chez les nouveau-nés très prématurés secondaires à la chorioamnionite 21,22,23,24,25,26,27,28. En plus de l’infection placentaire et de l’inflammation, la septicémie néonatale est un facteur de risque supplémentaire important et peut jouer un rôle central dans la progression de l’IVH à la ventriculomégalie à la PHHP symptomatique et à l’intervention chirurgicale ultérieure²⁹. Les données précliniques et cliniques soutiennent que l’inflammation transmissible par le sang peut provoquer l’hydrocéphalie²⁰, et que l’inflammation systémique augmente la sécrétion de LCR par le plexus choroïde³⁰. De plus, les adultes atteints d’hémorragie sous-arachnoïdienne et d’hémorragie intraveineuse qui souffrent également de septicémie sont beaucoup plus susceptibles d’avoir besoin d’un shunt³¹. Des publications plus récentes ont confirmé que l’inflammation réduit la propulsion des cils mobiles épendymaires du LCR ^19,20,32 et la réabsorption du LCR par le système glymphatique 33,34,35,36. Dans l’ensemble, l’inflammation systémique est un facteur physiopathologique et clinique clé dans le PHHP¹.

Compte tenu de ces résultats, nous avons créé un modèle préclinique de PHHP adapté à l’âge. Ce modèle combine l’hémorragie intranatale immédiate et précoce avec la chorioamnionite, principale cause de naissance prématurée¹⁹. Cette approche expérimentale commence in utero, avec l’insuffisance placentaire, l’inflammation placentaire et l’inflammation intraamniotique qui définissent la chorioamnionite 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ^,20,21,22,
23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40^{,41,42,
43, 44, 45}. Plus précisément, nous récapitulons un syndrome de réponse inflammatoire fœtale, une neutrophilie placentaire et un microenvironnement pro-inflammatoire du SNC chez la période préprématurée via laparotomie abdominale chez des mères rates gravides au 18e jour embryonnaire (E18)37,38,39,40,41,42,43,44,45. Les lésions intra-utérines sont induites par une occlusion bilatérale temporaire de l’artère utérine entraînant une hypoxie-ischémie systémique transitoire (TSHI) suivie d’une injection intraamniotique de lipopolysaccharide (LPS)37,38,39,40,41,42,43,44,45. Par la suite, pour perturber la dynamique du LCR et catalyser le développement de l’hydrocéphalie chez les petits nés vivants, l’HVI est induite le 1er jour postnatal. Ceci est accompli par injection intra-ventriculaire bilatérale (ICV) de globules rouges lysés (GR) dans les ventricules latéraux 19,37,44. Les petits sont ensuite étudiés au fur et à mesure que l’hydrocéphalie se développe et tout au long de leur vie.

Le Comité de protection et d’utilisation des animaux (ACUC) de l’Université Johns Hopkins a approuvé toutes les procédures expérimentales décrites dans le présent document. Ce protocole utilise des mères de rats Sprague-Dawley gestantes et des petits des deux sexes.

1. Induction de la chorioamnionite sous E18

REMARQUE : La partie de ce protocole sur l’insulte in utero a déjà été publiée en détail, est résumée ci-dessus et fait l’objet d’un protocole JOVE séparé et d’une vidéo 19,37,38,39,40,41,42,43,44,46. En bref, les rates Sprague-Dawley femelles enceintes subissent une laparotomie abdominale au 18e jour embryonnaire (E18) pour induire une chorioamnionite, qui comprend l’administration de TSHI et de LPS intraamniotique.

1. Anesthésie
   1. Induire une anesthésie chez la mère de rat gravide E18 avec 2-4 % d’isoflurane.
   2. Retirez la mère enceinte de la chambre d’induction et placez le rat en position couchée sur une couverture d’eau circulante chirurgicale drapée réglée à 37 °C.
   3. Appliquez une pommade ophtalmique pour prévenir le dessèchement de la cornée. Pressez doucement une patte pour confirmer l’absence de réflexe de pincement des orteils. Surveillez la profondeur de l’anesthésique toutes les 15 à 20 minutes et augmentez la dose d’isoflurane en cas de réponse positive au pincement des orteils.
   4. Administrer de la buprénorphine à libération prolongée (0,1 mg/kg SC) sur la nuque.
2. Préparation chirurgicale et gommage
   1. À l’aide d’une technique stérile standard, rasez l’abdomen.
   2. Frottez l’abdomen 3 fois avec une alternance de bétadine et d’éthanol à 70 %.
   3. Drapez l’animal à l’aide de champs chirurgicaux stériles.
3. Laparotomie abdominale
   1. Faites une incision médiane de 3 cm sur la peau abdominale préparée avec un scalpel.
   2. Utilisez des pinces et des ciseaux chirurgicaux pour maintenir la couche fasciale abdominale et faites une incision de la linea alba avasculaire de la couche musculaire pour accéder à la cavité péritonéale.
   3. Extérioriser l’utérus.
   4. Isolez et clampez les artères utérines à l’aide de pinces d’anévrisme pendant 60 min. Maintenez la température et maintenez le contenu intraabdominal humide avec une solution saline stérile.
   5. Retirez les clips et injectez 100 μL de LPS (4 μg/sac de solution de LPS) dans chaque sac amniotique de chaque fœtus. Ne dérangez pas le fœtus ou le placenta.
   6. Irriguez généreusement les cornes utérines et le champ 3x avec une solution saline stérile.
4. Fermeture de la laparotomie
   1. Replacez les cornes utérines dans la cavité péritonéale.
   2. Rapprochez les bords de la couche musculofasciale et fermez-la à l’aide d’une suture 3-0.
   3. Rapprochez la couche cutanée et fermez la peau à l’aide d’une suture 3-0.
   4. À l’aide d’une aiguille de 26 g, injectez par voie sous-cutanée 0,125 % de bupivacaïne sur les bords de la plaie.
   5. Pour les contrôles simulés, effectuez la laparotomie pendant la même durée pour contrôler la durée de l’anesthésie. Ne clampez pas les artères et n’administrez pas d’injections intraamniotiques. À la fin de la procédure, fermez la laparotomie en deux couches (muscle abdominal, fascia et peau) à l’aide d’une suture 3-0. Dans tous les cas, les petits naissent à terme (E21/22) et sont pris en charge par la mère.

2. Préparation des globules rouges lysés sur P1

1. Prélèvement de sang
   1. Prendre un petit rat Sprague-Dawley mâle et une femelle au jour 1 postnatal (P1) d’une portée qui a souffert de chorioamnionite le E18. Décapitez rapidement chaque chiot donneur avec des ciseaux chirurgicaux dédiés.
      REMARQUE : Nous utilisons 1 chiot mâle et 1 chiot femelle pour la collecte de sang afin d’éliminer un biais sexuel potentiel en représentant chacun dans les cohortes de donneurs. De plus, nous utilisons une paire de sexe apparié pour garantir un volume et un rendement suffisants de globules rouges lysés pour injecter leurs compagnons de portée. En règle générale, chaque petit donneur produit suffisamment de globules rouges lysés pour effectuer l’injection d’ICV sur un maximum de 4 à 5 compagnons de portée.
   2. Prélevez immédiatement le sang dans un tube de microcentrifugation de 2 ml contenant 0,2 ml de solution saline stérile, en prenant soin de ne recueillir que le sang qui s’écoule librement après la décapitation et de ne pas gratter ou presser pour produire plus de sang, car cela conduit à une hémolyse prématurée. Vortex bien.
      REMARQUE : La quantité exacte de sang varie en fonction de l’animal donneur et du poids, mais elle doit être maximale tout en maintenant les précautions ci-dessus.
   3. Hacher/émincer les caillots sanguins avec de petits ciseaux chirurgicaux.
   4. Centrifuger la suspension sanguine à 500 × g pendant 10 min à 4 ^°C, retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 0,2 mL de solution saline stérile. Vortex bien.
   5. Hacher/hacher les caillots sanguins résiduels post-vortex avec de petits ciseaux chirurgicaux.
   6. Répétez les étapes 2.1.4-2.1.5 deux fois de plus pour un total de 3 fois, en nettoyant les ciseaux chirurgicaux avec un spray d’éthanol à 70 % entre chaque cycle de lyse.
2. Lyse des globules rouges
   1. Après la centrifugation finale, ajouter 0,25 mL de solution saline stérile à la pastille ; Vortex bien.
   2. Placez la suspension sur de la glace carbonique pendant 5 min.
   3. Retirez la suspension de la glace sèche, placez-la dans un incubateur réglé à 37,5 ^°C pendant 5 minutes jusqu’à ce qu’elle soit complètement décongelée, et agitez bien.
   4. Répétez les cycles de congélation et de décongélation pour un total de 3 fois (trois gels et trois dégels).
   5. À la fin du dernier dégel, vortex et effectuez une rotation rapide. Les RBC sont maintenant lysés et prêts à l’emploi.
      REMARQUE : Le mélange doit être d’une couleur opaque semblable à du jus de tomate et être facilement aspiré dans des seringues.

3. Injections intra-ventriculaires de globules rouges lysés sur P1

1. Anesthésie par hypothermie
   1. Placez une petite plate-forme sur de la glace humide pour refroidir.
   2. Placez une lingette sèche de laboratoire sur le dessus pour protéger la peau du chiot.
      REMARQUE : Cette surface froide plane est utilisée pour l’anesthésie et l’injection des chiots.
   3. Transférer sur le petit (âgé de P1) du coussin chauffant sur la lingette de travail sur la plate-forme froide pour induire l’anesthésie par hypothermie.
   4. Confirmez la profondeur de l’anesthésie en serrant une patte et en confirmant l’absence de réflexe de pincement des orteils.
   5. Réglez une lampe chirurgicale externe sur ses réglages les plus lumineux.
   6. Avec un assistant utilisant son index et son majeur pour maintenir doucement la ligne médiane de la tête de l’animal, transilluminez le crâne pour visualiser les ventricules latéraux à travers le crâne. Identifiez le bregma en visualisant le sinus sagittal supérieur (ligne médiane) à travers la peau et en palpant la suture coronale avec de fines pinces comme points de repère d’intersection.
2. Injection ICV
   1. Essuyez la tête du chiot anesthésié avec un coton-tige imbibé d’éthanol à 70 %.
   2. Identifiez et marquez le site d’injection à 1 mm latéral de la suture sagittale, à mi-chemin entre lambda et bregma.
   3. Après la visualisation, utilisez une seringue à insuline de 0,3 mL de 8 mm de long et 31 G avec une aiguille percutanée ultrafine pour injecter 20 μL de globules rouges lysés dans le ventricule latéral droit. Insérez l’aiguille directement vers le bas à l’aide d’une technique à main levée sur une profondeur d’environ la moitié de la longueur de l’aiguille et injectez et retirez l’aiguille lentement (processus d’injection et de retrait sur environ 10 à 15 s).
   4. Laissez l’aiguille en place pendant quelques secondes après l’injection pour empêcher la sortie des globules rouges lysés injectés.
   5. Répétez l’opération avec le ventricule latéral gauche et injectez 20 μL de globules rouges lysés.
   6. Placez le chiot sur un coussin chauffant réglé à 37,5 ^°C pour se remettre de l’anesthésie.
   7. Notez le sexe du petit et attribuez-lui un identificateur unique de l’animal.
   8. Ne remettez le chiot dans la cage de la maison qu’après s’être complètement rétabli sur le coussin chauffant et avoir repris conscience afin que l’animal puisse maintenir en toute sécurité sa position couchée sternale.
   9. Surveillez quotidiennement tous les bébés rats pour leur santé et leur bien-être.

4. Confirmation de la réussite de l’hémorragie intraventriculaire bilatérale sur P2

1. Échographie de la tête
   1. Pour vous préparer à l’échographie de la tête, retirez les chiots P2 de leur cage domestique.
   2. Placez du gel à ultrasons sur la sonde à ultrasons et positionnez la sonde sur le dessus du crâne.
   3. Avec une pression extrêmement légère, déplacez la sonde pour visualiser les ventricules. Confirmer l’hyperéchogénicité bilatérale dans les ventricules latéraux représentant l’HVI.

5. Confirmation du succès de l’hydrocéphalie posthécorragique

1. Mesure de la distance intra-auriculaire (IAD), un substitut de la circonférence de la tête, pour confirmer la macrocéphalie
   1. Pour vous préparer à la mesure, procurez-vous un petit ruban à mesurer approprié pour mesurer la circonférence de la tête, idéalement avec des désignations millimétriques clairement visualisées.
   2. Demandez à un observateur masqué de retirer le chiot de sa cage domestique.
   3. Tout en tenant doucement le chiot, mesurez la distance d’une oreille à l’autre (distance intra-aurale, IAD) et notez la valeur en millimètres.
   4. Répétez l’IAD tous les jours de P1 à P15 et tracez graphiquement les valeurs. Suivre en série l’IAD et mesurer à nouveau à P21 lors de la relocalisation des petits dans de nouvelles cages physiquement séparées de la mère (qui est le point de temps standard pour le sevrage des petits). Répétez l’IAD par la suite tous les 5 jours en commençant à P25 jusqu’à P60.
2. Mesure de la pression d’ouverture pour confirmer une pression intracrânienne élevée
   1. Demandez à un observateur masqué de retirer le chiot de sa cage d’origine.
   2. Anesthésier avec 75 à 100 mg/kg de kétamine intrapéritonéale (IP) et 5 à 10 mg/kg de xylazine IP en préparation de l’euthanasie.
   3. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en serrant une patte et en confirmant l’absence de pincement des orteils/réflexe de pédale.
   4. Insérez une petite aiguille (31 G) reliée à un manomètre dans l’espace de la jonction cervicomédullaire du LCR.
   5. Enregistrez la pression d’ouverture sur le manomètre.
   6. Retirez l’aiguille et décapitez le rat avec des ciseaux tranchants et procédez au prélèvement de tissus.
3. Imagerie par résonance magnétique (IRM) ex-vivo pour l’évaluation de la ventriculomégalie
   1. Anesthésier avec 75-100 mg/kg de kétamine intrapéritonéale (IP) et 5-10 mg/kg IP Xylazine en préparation de l’euthanasie.
   2. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en serrant une patte et en confirmant l’absence de pincement des orteils/réflexe de pédale.
   3. Perfuser les rats avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), suivie de 4 % de paraformaldéhyde (PFA) jusqu’à ce qu’ils soient bien fixés.
   4. Retirez le cerveau et fixez-le dans 4 % de PFA
   5. Encastrer le cerveau dans de l’agarose à 2 % dans un tube conique de 50 ml. Laissez-le reposer à température ambiante.
   6. Transférez le cerveau vers l’IRM pour l’IRM ex vivo .
   7. Exécutez l’IRM 11.7T comme suit : T2 Turbo RADE ; TE/TR = 30,0/3000 ms ; moy = 2 ; Espacement des échos = 10.000 ms ; Facteur RARE = 8 ; nombre de tranches = 30 ; épaisseur de la tranche = 1 mm ; taille de l’image = 128 x 128 ; Champ de vision = 28 mm x 28 mm ; résolution de tranche = 0,219 x 0,219 mm² ; FA = 90,0°.
      REMARQUE : Bien que l’imagerie par IRM fournisse la preuve de la réussite de la modélisation du PHHP, il n’est pas nécessaire de scanner tous les cerveaux d’une cohorte donnée pour vérifier le PHHP. Les mesures IAM et ICP sont suffisantes pour vérifier comme décrit ci-dessus. En fin de compte, la capacité d’un chercheur à effectuer une IRM in vivo ou ex vivo dépendra de divers facteurs tels que l’accès au scanner IRM, les fonds et les capacités techniques. Cette étape est particulièrement utile pour la validation lors de l’intégration récente du modèle PHHP. Il est essentiel de noter qu’en l’absence de signes documentés d’augmentation de la pression intracrânienne, tels qu’une pression d’ouverture élevée, des signes isolés de ventriculomégalie à l’imagerie IRM ne représentent pas une hydrocéphalie.

En utilisant ce modèle, l’hydrocéphalie se développe dans les jours et les semaines suivant l’injection de globules rouges lysés. La figure 1 présente une représentation d’un plan d’expérience typique et de la progression de l’hydrocéphalie. Nous avons évalué 5 à 6 animaux fictifs et 6 à 8 animaux PHHP par groupe. À l’âge juvénile, les rats atteints de PHHP présentaient une macrocéphalie (figure 2), ...

Ce protocole pour l’induction de la PHHP permet des mesures rigoureuses, quantifiables et cliniquement traduisibles de la structure et de la fonction cérébrales concomitantes aux caractéristiques phénotypiques de l’hydrocéphalie, y compris l’élévation chronique de la PIC, la ventriculomégalie et la macrocéphalie, de la naissance à l’âge adulte⁴. Des tests biochimiques, histologiques et fonctionnels peuvent être utilisés pour évaluer la santé...

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Les auteurs sont reconnaissants du financement fourni par les National Institutes of Health (R01HL139492), le Congressionally Directed Medical Research Program (W81XWH1810166, W81XWH1810167, W81XWH2210461 et W81XWH2210462), l’Association de l’hydrocéphalie et l’Institut de recherche Rudi Schulte.