大鼠早产儿出血后脑积水建模

早产儿出血后脑积水 （PHHP） 可以通过结合绒毛膜羊膜炎和脑室内出血来模拟新生大鼠。这些产前和产后事件的结合准确地概括了 PHHP 在整个生命周期中的临床特征，包括大头畸形、脑室扩大和颅内压升高。

早产儿出血后脑积水 （PHHP） 是胎龄小于 32 周 （GA） 的极早产儿严重脑室内出血 （IVH） 的严重后遗症。PHHP 的定义是脑脊液 （CSF） 的积累与颅内压 （ICP） 升高的临床症状相关。患有 PHHP 的婴儿终生依赖分流，其中一半在出生后的第一年需要重复手术，许多婴儿在整个生命周期中需要多次额外的手术。产前绒毛膜羊膜炎使早产儿易患严重的 IVH，并且需要手术治疗新生儿败血症的 PHHP 趋势。这些临床特征表明全身性炎症是 PHHP 病理生理学的一个组成部分。

在这里，我们定义了一个动物模型，它概括了大鼠 PHHP 的所有临床方面和基本特征。该方案的目的是说明如何使用裂解的红细胞在 子宫内 绒毛膜羊膜炎和产后 IVH 结合以产生 PHHP。这种临床前方法产生进行性大头畸形和圆顶颅骨、颅内压升高和脑室扩大，这些可以通过磁共振成像 （MRI） 或显微镜检测到。除了 CSF 动力学的持续中断外，大鼠在成年后还会出现认知延迟和功能障碍。因此，这个临床前平台促进了長春独特且无与伦比的转化研究，包括分子、细胞、生化、组织学、成像和功能结果测量。它还可用于同时对脉络丛、室管膜运动纤毛和淋巴系统进行严格分析。最后，它也可以成为研究治疗脑积水的新型手术干预策略和非手术治疗方法的宝贵临床前工具。

早产儿出血后脑积水 （PHHP） 仍然是一个重大的公共卫生问题。PHHP 定义为脑脊液 （CSF） 的症状性积聚伴有继发于脑室内出血 （IVH） 的颅内压 （ICP） 升高，PHHP 是早产儿脑病的严重表现，是导致早产儿和获得性脑积水全球负担的重要因素 ^1,2。在全球范围内，每年约有 400,000 名婴儿出生时患有脑积水或获得终生脑积水^{负担 3}，其中许多婴儿因缺乏治疗而死亡³。PHHP 在发达国家常见于患有严重 IVH 的极早产儿（妊娠 <32 周），并且经常影响已经患有其他危及生命的合并症的最严重的婴儿 ^4,5。

脑积水唯一可用的治疗方法是手术⁶。当婴儿在第一次永久性干预时年龄超过 6 个月时，无论是脑室腹腔 （VP） 分流以转移脑脊液 （CSF）、内窥镜第三脑室造口术 （ETV） 还是脉络丛凝血 （ETV-CPC） 的 ETV，外科手术都能延长寿命⁷。最常见的选择是 VP 分流术，通常在一年内失败，并使儿童终生容易出现并发症、重复手术和住院治疗，给儿童、家庭和社会带来巨大代价。⁸ 特别是，分流可能随时失效的焦虑对家庭来说是沉重的负担⁹。照顾有症状的脑积水儿童，包括频繁的手术，是儿科医疗保健支出的主要原因 ^{10,11,12,13,14}。2003 年，儿童分流相关支出的年度估计成本为 20 亿美元¹⁵。虽然分流儿童仅占住院人数的 0.6%，但他们产生的费用占儿科住院费用的 3.1%¹⁵。因此，发现治疗 PHHP 的安全、非手术疗法至关重要。

在婴儿中，PHHP 在 IVH 后发生，临床时间过程在最初发现脑出血后持续数周至数月。脑积水临床研究网络 （HCRN） 进行的一项研究证实，VP 分流术仍然是 PHHP¹⁶ 新生儿的最佳手术选择。即使对于高收入国家能够获得熟练的儿科神经外科护理的 PHHP 儿童，结果也远非最佳，>50% 的 PHHP 婴儿的分流术需要在前 2 年内进行手术翻修⁸。尽管明确需要确定更安全、更有效的 PHHP 治疗方法，但研究仍面临障碍。进展受到阻碍，部分原因是关于 PHHP 的临床前文献通常无法适当区分空位脑积水引起的脑室扩大 ^17,18 和有症状的脑积水伴大头畸形^19,20。事实上，脑积水的发育模型应包括进行性大头畸形和/或 ICP¹ 升高的测量。

结合临床和临床前见解改进了研究设计，并促进了我们对 PHHP² 的理解。在全球不同中心进行的研究表明，IVH 最常见于继发于绒毛膜羊膜炎的极早产新生儿^{21、22、23、24、25、26、27、28}。除了胎盘感染和炎症外，新生儿败血症也是一个重要的危险因素，在从 IVH 到脑室扩大再到有症状的 PHHP 和随后的手术干预中起着核心作用²⁹。临床前和临床数据支持血源性炎症可导致脑积水²⁰，全身性炎症会增加脉络丛³⁰ 对 CSF 的分泌。此外，患有蛛网膜下腔出血和 IVH 的成人同时患有败血症，更可能需要分流³¹。最近的文献证实，炎症会减少室管膜运动纤毛对 CSF 的推进 19,20,32 和 CSF 被淋巴系统重吸收 33,34,35,36。总体而言，全身炎症是 PHHP¹ 的关键病理生理学和临床驱动因素。

考虑到这些发现，我们创建了一个适合年龄的 PHHP 临床前模型。该模型将出生后即刻和早期的 IVH 与绒毛膜羊膜炎相结合，绒毛膜羊膜炎是早产的主要原因¹⁹。这种实验方法从子宫开始，胎盘功能不全、胎盘炎症和羊膜内炎症定义为绒毛膜羊膜炎 ^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19、20、21、22、}
23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40^，41,42，
43,44,45。具体来说，我们通过在胚胎第 18 天 （E18） 对怀孕大鼠母鼠进行腹部剖腹手术，概括了早产期胎儿炎症反应综合征、胎盘中性粒细胞增多症和促炎性 CNS 微环境37,38,39,40,41,42,43,44,45.宫内损伤是由暂时性双侧子宫动脉闭塞引起的，导致短暂性全身性缺氧缺血 （TSHI），然后羊膜腔注射脂多糖 （LPS）37,38,39,40,41,42,43,44,45.随后，为了扰乱 CSF 动力学并催化活产幼崽脑积水的发育，在出生后第 1 天诱导 IVH。这是通过将同窝裂解的红细胞 （RBC） 双侧脑室内注射 （ICV） 到侧脑室来实现^的 19,37,44。然后研究脑积水的发展和整个生命周期中的幼崽。

约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会 （ACUC） 批准了此处描述的所有实验程序。该协议利用怀孕的 Sprague-Dawley 鼠坝和两性幼崽。

1. E18 上绒毛膜羊膜炎的诱发

注意：本协议的子宫内侮辱部分之前已详细发布，上面总结了，并且是单独的 JOVE 协议和视频的主题 19,37,38,39,40,41,42,43,44,46.简而言之，怀孕的雌性 Sprague-Dawley 大鼠在胚胎第 18 天 （E18） 进行腹部剖腹手术以诱导绒毛膜羊膜炎，其中包括 TSHI 和羊膜内 LPS 给药。

1. 麻醉
   1. 在 E18 怀孕大鼠母马中用 2-4% 异氟醚诱导麻醉。
   2. 从诱导室中取出怀孕的母马，将大鼠仰卧位放在设置为 37 °C 的悬垂手术循环水毯上。
   3. 涂抹眼药膏以防止角膜干燥。轻轻挤压一只爪子，确认没有脚趾捏反射。每 15-20 分钟监测一次麻醉深度，并在脚趾捏合反应阳性的情况下增加异氟醚。
   4. 在颈背施用丁丙诺啡缓释剂 （0.1 mg/kg SC）。
2. 手术准备和擦洗
   1. 使用标准无菌技术，剃掉腹部。
   2. 用交替的 betadine 和 70% 乙醇擦洗腹部 3 次。
   3. 使用无菌手术布覆盖动物。
3. 腹部剖腹手术
   1. 用手术刀在准备好的腹部皮肤上做一个 3 厘米的中线切口。
   2. 使用镊子和手术剪刀支撑腹部筋膜层，并在肌肉层的无血管白线切开以进入腹膜腔。
   3. 将子宫外化。
   4. 用动脉瘤夹隔离并夹住子宫动脉 60 分钟。保持温度，用无菌盐水保持腹腔内容物湿润。
   5. 取下夹子，将 100 μL LPS（4 μg/sac LPS 溶液）注射到每个胎儿的每个羊膜囊中。不要打扰胎儿或胎盘。
   6. 冲洗子宫角，并用无菌盐水慷慨地喷洒 3 次。
4. 闭合剖腹手术
   1. 更换腹膜腔中的子宫角。
   2. 重新接近肌肉筋膜层边缘并使用连续的 3-0 缝合线闭合。
   3. 重新接近皮肤层并使用连续的 3-0 缝合线闭合皮肤。
   4. 使用 26 G 针头在伤口边缘周围皮下注射 0.125% 布比卡因。
   5. 对于假对照，进行相同长度的剖腹手术以控制麻醉持续时间。不要夹住动脉，也不要进行任何羊膜腔注射。在手术结束时，使用 3-0 缝合线将剖腹手术分成两层（腹部肌肉、筋膜和皮肤）。在所有情况下，幼崽都是足月出生的 （E21/22），并由母亲照顾。

2. 制备 P1 上裂解的红细胞

1. 采血
   1. 在出生后第 1 天 （P1） 从一窝在 E18 上经历绒毛膜羊膜炎的窝中取出一只雄性和一只雌性 Sprague-Dawley 大鼠幼崽。用专用的手术剪刀快速斩首每只供体幼崽。
      注意：我们使用 1 只雄性和 1 只雌性幼犬进行采血，通过在供体队列中代表每只幼犬来消除潜在的性别偏见。此外，我们使用性别匹配的配对来保证裂解红细胞的足够体积和产量来注射它们的同窝伴侣。通常，每只供体幼崽产生足够的裂解红细胞，以对最多 4-5 只同窝仔进行 ICV 注射。
   2. 立即将血液收集到含有 2 mL 无菌盐水的 0.2 mL 微量离心管中，注意只收集斩首后自由流动的血液，不要刮擦或挤压以产生更多血液，因为这会导致过早溶血。涡旋好。
      注意：确切的血液量因供体动物个体和体重而异，但在保持上述预防措施的同时应保持最大。
   3. 用小手术剪刀切碎血块。
   4. 将血液悬浮液在 4 ^°C 下以 500 × g 离心 10 分钟，去除上清液，并将沉淀重悬于 0.2 mL 无菌盐水中。涡旋好。
   5. 用小手术剪刀切碎/切碎涡流后残留血凝块。
   6. 再重复步骤 2.1.4-2.1.5 两次，总共 3 次，在每轮裂解之间用 70% 乙醇喷雾清洁手术剪刀。
2. 红细胞裂解
   1. 最后离心后，向沉淀中加入 0.25 mL 无菌盐水;涡旋好。
   2. 将悬浮液放在干冰上 5 分钟。
   3. 从干冰中取出悬浮液，将其置于 37.5 ^oC 的培养箱中 5 分钟，直至完全解冻，然后充分涡旋。
   4. 重复冻融循环，总共 3 次（3 次冻结和 3 次解冻）。
   5. 在最后一次解冻结束时，涡旋并执行快速旋转。红细胞现已裂解，可供使用。
      注意：混合物应为 不透明的 番茄汁状颜色，并且易于吸入注射器中。

3. 在 P1 上脑室内注射裂解的红细胞

1. 使用低温麻醉
   1. 在湿冰上放置一个小平台冷却。
   2. 在上面放一块干燥的实验室湿巾以保护幼犬的皮肤。
      注意：这种平坦的冷表面用于麻醉和注射幼崽。
   3. 将幼犬（P1 岁）从加热垫转移到寒冷平台上的任务擦拭上，以通过体温过低诱导麻醉。
   4. 通过挤压爪子并确认没有脚趾捏反射来确认麻醉深度。
   5. 将外部手术灯设置为最亮的设置。
   6. 助手用食指和中指轻轻保持动物的头部中线，透射颅骨以透过颅骨观察侧脑室。通过皮肤观察矢状窦上部（中线）并用细镊子触诊冠状缝合线作为交叉标志来识别前囟。
2. ICV 注射
   1. 用浸泡在 70% 乙醇中的棉签擦拭麻醉幼犬的头部。
   2. 识别并将注射部位标记为矢状缝合线外侧 1 毫米，在 lambda 和囟之间。
   3. 可视化后，使用 0.3 mL、8 mm 长、31 G 胰岛素注射器和超细经皮针头将 20 μL 裂解的红细胞注射到右心室。使用徒手技术将针头笔直向下插入大约针头长度一半的深度，然后缓慢注射和取出针头（注射和取出过程大约需要 10-15 秒）。
   4. 注射后将针头留在原位几秒钟，以防止注射的裂解红细胞流出。
   5. 对左侧心室重复并注射 20 μL 裂解的红细胞。
   6. 将幼犬放在 37.5 ^oC 的加热垫上以从麻醉中恢复。
   7. 记录幼崽的性别并分配一个唯一的动物标识符。
   8. 只有在加热垫上完全恢复并恢复意识后，才能将幼犬放回家笼，以便动物可以安全地保持胸骨卧位。
   9. 每天监测所有老鼠幼崽的健康状况。

4. P2 确认双侧脑室内出血成功

1. 头部超声
   1. 为了准备头部超声检查，请将 P2 幼崽从家笼中取出。
   2. 将超声凝胶放在超声探头上，并将探头放在颅骨顶部。
   3. 用极轻的压力移动探头以观察心室。确认代表 IVH 的侧脑室双侧高回声。

5. 确认出血后脑积水成功

1. 测量耳内距离 （IAD），这是头围的替代指标，以确认大头畸形
   1. 为了准备测量，请购买一个适合测量头围的小卷尺，最好带有清晰可见的毫米名称。
   2. 让戴面具的观察员将幼犬从他们的家笼中取出。
   3. 在轻轻抱着幼犬的同时，测量耳朵到耳朵的距离（耳内距离，IAD）并以毫米为单位记录该值。
   4. 每天从 P1 到 P15 重复 IAD 并绘制值图。将幼崽搬迁到与母猪物理分离的新笼子（这是幼崽断奶的标准时间点），连续跟踪 IAD 并在 P21 再次测量。随后每 5 天重复一次 IAD，从 P25 开始，直到 P60。
2. 测量开孔压以确认颅内压升高
   1. 让戴着面具的观察员将幼犬从家笼中取出。
   2. 用 75-100 mg/kg 腹膜内 （IP） 氯胺酮和 5-10 mg/kg IP 甲苯噻嗪麻醉，为安乐死做准备。
   3. 通过挤压爪子并确认没有脚趾捏/踏板反射来检查麻醉深度。
   4. 将一根连接到压力计的小针 （31 G） 插入颈髓交界处 CSF 间隙。
   5. 在压力计上记录打开压力。
   6. 取下针头，用锋利的剪刀将大鼠斩首，然后继续进行组织收集。
3. 离体 磁共振成像 （MRI） 评估脑室扩大
   1. 用 75-100 mg/kg 腹膜内 （IP） 氯胺酮和 5-10 mg/kg IP 甲苯噻嗪麻醉，为安乐死做准备。
   2. 通过挤压爪子并确认没有脚趾捏/踏板反射来检查麻醉深度。
   3. 用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 灌注大鼠，然后用 4% 多聚甲醛 （PFA） 灌注直至固定良好。
   4. 取出大脑，并在 4% PFA 中滴加固定大脑
   5. 将大脑嵌入 50 mL 锥形管中的 2% 琼脂糖中。让它在室温下静置。
   6. 将大脑转移到 MRI 扫描仪进行离体 MRI。
   7. 按如下方式运行 11.7T MRI：T2 Turbo RARE;TE/TR = 30.0/3000 毫秒;平均 = 2;回波间距 = 10.000 毫秒;稀有因子 = 8;切片数量 = 30;切片厚度 = 1 mm;图像大小 = 128 x 128;视场角 = 28 毫米 x 28 毫米;切片分辨率 = 0.219 x 0.219 mm²;FA = 90.0°。
      注意：虽然 MRI 成像提供了成功 PHHP 建模的证据，但不需要扫描给定队列中的所有大脑来验证 PHHP。IAM 和 ICP 测量足以如上所述进行验证。最终，研究者进行 体内 或 离体 MRI 的能力将取决于多种因素，例如 MRI 扫描仪访问、资金和技术能力。此步骤对于新合并 PHHP 模型时的验证特别有用。需要注意的是，在没有颅内压升高的迹象（例如开张压升高）的情况下，MRI 成像上孤立的脑室扩大表现 并不 代表脑积水。

使用该模型，脑积水在注射裂解红细胞后的几天和几周内发生。图 1 提供了脑积水的典型实验设计和进展的表示。我们评估了每组 5-6 只假动物和 6-8 只 PHHP 动物。作为幼年，患有 PHHP 的大鼠表现出大头畸形（图 2）、颅内压升高（图 3）和脑室扩大（图4）。这些发现的星座和组合代...

这种诱导 PHHP 的方案允许对伴随脑积水表型标志的大脑结构和功能进行严格、可量化和临床可转化的结果测量，包括从出生到成年的 ICP 慢性升高、脑室扩大和大头畸形⁴。生化、组织学和功能测定可用于评估脉络丛、室管膜和淋巴系统以及灰质和白质¹⁹ 的健康状况。此外，该模型可以支持功能性 CSF 和活细胞纤毛成像与多模式神经成像?...

作者没有需要披露的利益冲突。

作者感谢美国国立卫生研究院 （R01HL139492）、国会指导医学研究计划 （W81XWH1810166、W81XWH1810167、W81XWH2210461 和 W81XWH2210462）、脑积水协会和 Rudi Schulte 研究所提供的资助。