Разработка неосложненной модели легкой черепно-мозговой травмы, модифицированной методом Weight-Drop и подтвержденной методами магнитно-резонансной томографии

В данной работе мы представляем протокол для создания животной модели закрытой черепно-мозговой травмы, воспроизводящей нейроимиджевый исход неосложненной легкой черепно-мозговой травмы с сохраненной структурой мозга в острой фазе и долгосрочной атрофией мозга. Продольная магнитно-резонансная томография является основным методом, используемым для получения доказательств.

Легкая черепно-мозговая травма (ЧМТ), известная как сотрясение мозга, составляет более 85% травм головного мозга во всем мире. В частности, неосложненная ЧМТ с отрицательными результатами при рутинной клинической визуализации в острой фазе препятствует раннему и надлежащему лечению этих пациентов. Было признано, что различные параметры воздействия могут влиять на развитие последующих нейропсихологических симптомов после ЧМТ и даже ускорять их. Тем не менее, связь параметров удара во время сотрясения мозга с исходом подробно не изучалась. В настоящем исследовании была подробно описана и продемонстрирована животная модель с закрытой черепно-мозговой травмой (ЧС), модифицированная на основе парадигмы травмы при снижении веса. Взрослые самцы крыс Спрэг-Доули (n = 20) были случайным образом распределены в группы ОМС с различными параметрами воздействия (n = 4 в группе). В течение 50-дневного периода исследования проводились продольные исследования МРТ, включая Т2-взвешенную визуализацию и диффузионно-тензорную визуализацию, а также последовательные поведенческие оценки, такие как модифицированная оценка неврологической тяжести (mNSS) и тест ходьбы по лучу. Иммуногистохимическое окрашивание по поводу астроглиоза проводили на 50-е сутки после травмы. Худшие поведенческие показатели наблюдались у животных после повторяющейся ВСН по сравнению с группой с одной травмой и симуляцией. При использовании продольной магнитно-резонансной томографии (МРТ) в течение 24 ч после травмы не наблюдалось значительного ушиба головного мозга. Тем не менее, атрофия коры головного мозга и изменение фракционной анизотропии коры головного мозга (ЖК) были продемонстрированы на 50-е сутки после травмы, что свидетельствует об успешной репликации клинической неосложненной ЧМТ. Наиболее важным является то, что изменения в нейроповеденческих исходах и особенностях изображения, наблюдаемые после ЧМТ, зависели от количества ударов, интервалов между травмами и выбранного места удара у животных. Эта модель мЧМТ in vivo в сочетании с доклинической МРТ дает возможность исследовать повреждение головного мозга в масштабе всего мозга. Это также позволяет исследовать биомаркеры визуализации, чувствительные к ЧМТ, с различными параметрами воздействия и уровнями тяжести.

Легкая черепно-мозговая травма (ЧМТ) в первую очередь наблюдается у спортсменов, занимающихся контактными видами спорта, ветеранов вооруженных сил и лиц, попавших в дорожно-транспортные происшествия¹. На его долю приходится более 85 % всех зарегистрированных травм головы². Обширная этиология ЧМТ и ее растущая глобальная заболеваемость подчеркивают включение ЧМТ в качестве предварительного фактора риска развития нейродегенеративного заболевания с поздним началом в окружающей среде³. Неосложненная легкая ЧМТ характеризуется оценкой комы по шкале Глазго (GCS) 13-15, при этом при компьютерной томографии (КТ) или магнитно-резонансной томографии (МРТ) структурных аномалий не наблюдается. Общие симптомы, испытываемые пациентами с неосложненной ЧМТ, включают головные боли, головокружение, тошноту или рвоту, а также усталость. Тем не менее, лонгитюдная оценка исходов после неосложненной ЧМТ представляет собой значительную проблему из-за высокой частоты выбывания пациентов⁴.

Опасения по поводу повторяющихся ЧМТ возросли, особенно в сообществе профессиональных спортсменов Национальной футбольной лиги (НФЛ), что впоследствии повысило осведомленность среди непрофессиональных спортсменов⁵. Предполагается, что уязвимость мозга увеличивается после первоначальной ЧМТ, а последующие инсульты потенциально могут усугубить исход травмы. Недавние результаты, полученные в самой большой когорте доноров мозга футболистов, не только указывают на причастность предыдущего участия в футболе в тяжести хронической травматической энцефалопатии (ХТЭ), но и предполагают корреляцию между различными факторами, связанными с футболом, и риском и тяжестью ХТЭ⁶. Следовательно, растет обеспокоенность по поводу влияния количества сотрясений мозга и повторяющегося режима на исход травм. В доклинических исследованиях изучались невропатологические изменения, нейровоспалительный каскад и нейропсихологические нарушения после повторяющихся ЧМТ с использованием различных моделей закрытой черепно-мозговой травмы (ЧС) 7,8,9,10,11,12,13,14 . Тем не менее, исследование параметров удара на неосложненной модели ЧМТ, которая может близко имитировать повторяющиеся сотрясения головы, связанные со спортом, приводящие к функциональным нарушениям в острой фазе и атрофии мозга в хронической фазе, не было хорошо изучено.

Диффузионно-тензорная визуализация (DTI), метод оценки диффузии молекул воды, широко используется в исследованиях эффектов mTBI. Фракционная анизотропия (FA), ключевой показатель, полученный на основе DTI, количественно оценивает степень когерентности диффузии воды и предоставляет информацию о структурной организации аксонов и пучков нервных волокон. Предложено возмущение значений FA в белом веществе (WM) после mTBI в различных моделях 8,10,11,15,16,17. Кроме того, осевая диффузия (АД) и радиальная диффузия (РД), указывающие на целостность аксонов и миелина, изменялись после ЧМТ в доклинических исследованиях 10,15,16,18,19,20. Тем не менее, расхождения в результатах DTI между предыдущими исследованиями, вероятно, связаны с различиями в тяжести mTBI, различиями в параметрах воздействия, различными моделями mTBI и непоследовательными временными^{точками} наблюдения после травмы.

Таким образом, текущий документ по протоколу направлен на создание животной модели ЧМТ, предназначенной для оценки кумулятивных эффектов однократной и повторяющейся ЧМТ. Мы включили комплексные и лонгитюдные оценки, включая оценку благополучия животных, поведенческих исходов, параметров DTI и объема коры головного мозга, чтобы зафиксировать динамические изменения после травмы и изучить влияние различных параметров воздействия. Демонстрируя как острые функциональные нарушения, так и долгосрочные микроструктурные изменения, эта модель эффективно воспроизводит ключевые особенности неосложненной ЧМТ, которые не были полностью учтены в предыдущих исследованиях на животных. В данной работе мы предоставили подробный протокол разработки неосложненной модели мЧМТ с использованием модифицированного метода отбрасывания массы^с закрытой головкой ^8,11 и проведения продольной оценки после мЧМТ.

Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения Guidelines for Animal Research (Руководство по уходу и использованию лабораторных животных) и Animal Research: Reporting In Vivo Experiments. Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Национального университета Ян Мин Чао Тунг. Двадцать животных были случайным образом распределены в 5 групп (n = 4 в группе): (i) одиночный удар в сенсомоторную кору (SMCx/одиночный), (ii) двойной удар в SMCx с интервалом в 1 час (SMCx/2 удара/1 ч), (iii) двойной удар в SMCx с интервалом в 10 мин (SMCx/2 удара/10 мин), (iv) двойной удар в центральный мозг с интервалом в 1 ч (Центральный/2 удара/1 ч), и (v) фиктивная группа с только хирургическим вмешательством, но без воздействия непосредственно на голову, для оценки лонгитюдного исхода (Рисунок 1). Следует отметить, что интервалы между травмами, выбранные для этого исследования (интервалы 1 час против 10 минут), были разработаны таким образом, чтобы имитировать повторяющиеся субконтузионные удары 8,10,11,13,21, которые могут быть до тысячи раз в течение одного сезона, испытываемые спортсменами, занимающимися контактными видами спорта ^22,23.

1. Индукция закрытой черепно-мозговой травмы (ЧС)

ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые самцы крыс породы Спрэг-Доули в возрасте от 10 до 12 недель и весом более 250 г содержатся в 12/12-часовом цикле свет/темнота с ограниченным доступом к пище и воде.

1. Поместите крысу в небольшую индукционную камеру и обезболите ее смесью изофлурана (5%) и медицинского воздуха (2,5-3 л/мин). Вынимайте крысу из камеры до тех пор, пока она не перестанет реагировать на щипок лапой или хвостом.
2. Положите крысу на грелку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Включите грелку во время операции, чтобы поддерживать температуру тела крыс.
3. Поместите крысу на стереотаксическую раму и закрепите ее зубчатым стержнем. Вводите изофлуран в концентрации 2% с помощью подключенного носового конуса с медицинским воздухом со скоростью потока 1,5-2 л/мин для поддержания во время операции.
4. Расположите ушные планки. Убедитесь, что крыса расположена по центру и симметрична на стереотаксической раме.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические процедуры должны выполняться в асептических условиях. Инструменты были стерилизованы перед операцией с помощью парового автоклава, а их наконечники были дополнительно стерилизованы стерилизатором с шариками во время процедуры. Чтобы предотвратить заражение, на животное была наложена хирургическая простыня. Хирург носил шапочку, чтобы закрывать волосы, маску, чтобы закрывать лицо, и был экипирован лабораторным халатом и хирургическими перчатками во^{время процедуры.}
5. Приложите датчик пульсоксиметра к задней лапе животного для контроля частоты дыхания, частоты сердечных сокращений, уровня кислорода в крови, температуры тела животного.
6. Введите 1 мл/кг массы тела лидокаина (20 мг/мл) подкожно в шею крысы в качестве анальгетика.
7. Нанесите крем для удаления волос на голову животного и подождите 3 минуты. Сотрите крем тампонами из 70% изопропилового спирта.
8. Очистите выбритый участок несколько раз с помощью стерильного ватного тампона, смоченного в йоде. Удалите остатки йода с помощью ватного тампона, смоченного в 70% этаноле.
9. Сделайте разрез по средней линии длиной примерно 2-2,5 см на выбритой коже с помощью стерильного хирургического лезвия для доступа к поверхности черепа.
10. Удалите ткань на кости с помощью ватного диска, чтобы обнажить череп. Очистите поверхность черепа с помощью ватного тампона, смоченного в 0,9% физрастворе, затем очистите ее сухим ватным диском.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Швы черепа, а также брегма и лямбда теперь могут быть легко идентифицированы.
11. Определите брегму в качестве опорной точки для дальнейшего определения зоны падения на основе координат.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе для индукции CHI используются два набора координат: (-2,5,-2,0) (2,5 мм латерально 2,0 мм позади брегмы) на вершине сенсомоторной коры (SMCx), а также (0,-3,0) на вершине центрального мозга (центральном).
12. Определите выбранные координаты на поверхности черепа и зацементируйте круглый шлем из нержавеющей стали (диаметром 10 мм и толщиной 1 мм) над обозначенным участком с помощью стоматологического цемента. Снимите грелку и пульсоксиметр.
13. Переместите стереотаксическое устройство и крысу на подъемном столе (длина 14 см, ширина 8 см и глубина 6,15 см) под ударный элемент CHI.
14. Приподнимают тело крысы с помощью поролоновой губки (19 см в длину, 10 см в ширину и 4 см в глубину, плотностью 18 кг/м³ ).
15. Снимите крысу с ушных планок стереотаксической рамки. Держите крысу неподвижно на зубном стержне, соединенном с носовым конусом, поставляя 2% изофлуран. Убедитесь, что голова и тело выровнены в рострально-каудальном направлении.
16. Отрегулируйте подъемный стол так, чтобы между ударником CHI и шлемом не было места. Выключите изофлуран за 5 с непосредственно перед ударом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для уточнения выпрямляющего рефлекса вследствие черепно-мозговой травмы проводили временное прекращение приема изофлурана²⁵.
17. Сбросьте латунь весом 600 г с высоты 1 м через трубу из нержавеющей стали (высота 1 м с внутренним диаметром 20 мм для очистки колонны от грузов из нержавеющей латуни) к закрепленному ударному элементу с круглым наконечником, направленным на металлический шлем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные в фиктивной группе не испытали удара, так как латунная капля была выпущена без контакта со шлемом на голове крысы.
18. Опустите подъемный стол. Снимите крысу со стереотаксической рамки и положите крысу в лежачем положении на грелку.
19. Запишите время выпрямляющего рефлекса, то есть время, когда животное пытается перейти из положения лежа на спине в положение лежа^26,27.
    Примечание: Животные, подвергшиеся повторяющемуся воздействию ЦИ, были снова обезболены за 3 минуты до^{второго удара} . Для животных в группе SMCx/double/10 min, которые вовремя не вернулись в положение лежа, соответствующее время рефлекса выпрямления было зарегистрировано как 420 с.
20. После записи выпрямляющего рефлекса снова обезболите крысу изофлураном, используя шаг 1.1.
21. Обездвижите крысу с помощью стереотаксической рамки, используя шаг 1.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После подтверждения устойчивости шлема на верхней части столба, повторите шаги 1.13-1.17 еще раз для выполнения^2-го удара.
22. Снимите шлем. Удалите всю соединительную ткань и цемент с верхней части черепа.
23. Накройте череп стоматологическим цементом и дайте ему высохнуть. Убедитесь, что стоматологический цемент жесткий и твердый, с помощью задней части пинцета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стоматологический цемент был нанесен на верхнюю часть черепа для устранения артефактов восприимчивости, вызванных взаимодействием череп-воздух или череп-кровь между черепом и кожей головы после операции.
24. Закройте разрез с помощью 4-0 нейлоновых хирургических нитей с 4-5 независимыми узлами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рана составляет примерно 2-2,5 см в длину. Следите за тем, чтобы хирургические швы не имели капиллярного действия и были изготовлены из шелка или нейлонового материала. Не зашивайте разрез одним единственным узлом, чтобы предотвратить открытие раны из-за царапин животного.
25. Нанесите на операционное поле антибиотики местного действия (крем Дерманест) для предотвращения инфекций.
26. Введите 1 мл/кг массы тела карпрофена (50 мг/мл) подкожно в область шеи в качестве послеоперационного анальгетика.
27. Поместите крысу в чистую клетку на грелку, пока она не придет в сознание. Как только крыса сядет прямо, верните ее в домашнюю клетку.
28. Перорально вводите животному 5 мл ацетаминофена (24 мг/мл), смешанного с 200 мл воды, ежедневно в качестве анальгетика в течение 3 дней подряд после операции.

2. Магнитно-резонансная томография (МРТ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Т2-взвешенное изображение и диффузионно-тензорная визуализация проводятся с использованием последовательной системы ПЭТ/МРТ 7Т до ЦИ, а также через 1 и 50 дней после травмы (Рисунок 1). Базовую МРТ проводили в течение 1 недели до процедуры ОМС. Для оценки через 1 и 50 дней после ОМС поведенческие оценки проводились утром, а затем МРТ во второй половине дня в тот же день.

1. Обезболивают крысу в небольшой индукционной камере, заполненной смесью изофлурана (5%) и медицинского воздуха (2,5-3 л/мин).
2. Как только крыса перестанет реагировать на щипок лапой или хвостом, временно приостановите анестезию при переносе на колыбель животного в положении лежа головой вперед.
3. Поместите крысу в держатель для головы, соединенный с носовым конусом, подающим 2% изофлуран с медицинским воздухом со скоростью потока 1,5-2 л/мин для обслуживания во время получения изображения.
4. Зафиксируйте голову небольшим кусочком скотча, чтобы избежать движения во время сканирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесите немного зубной пасты на голову крысы в первый день после ЧС, чтобы предотвратить артефакты магнитной восприимчивости из-за удаления кожи головы^28,29.
5. Подложите давящую подушку под грудную клетку крысы для контроля дыхания. Прикрепите зажимы оксиметра к задней конечности, чтобы контролировать частоту сердечных сокращений.
6. Введите ректальный зонд для измерения ректальной температуры. Накрывайте крысу согревающим одеялом с циркуляцией теплой воды и тканевым обертыванием во время эксперимента для поддержания температуры тела.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего эксперимента следите за физиологическими условиями, включая частоту сердечных сокращений, частоту дыхания и прямую температуру. Перед сканированием проверьте все физиологические сигналы крысы, чтобы убедиться в качестве монитора жизненно важных показателей.
7. Используйте лазерную систему позиционирования сканера ПЭТ/МРТ, чтобы отметить центр головы для точного выравнивания.
8. Переместите животное в отверстие МРТ автоматически с помощью моторизованной системы транспортировки животных до тех пор, пока центр головы не совпадет с изоцентром сканера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Моторизованная система транспортировки животных, интегрированная в систему ПЭТ/МРТ, обеспечивает точное позиционирование животного и оптимизирует рабочий процесс при переходе от одного метода визуализации к другому.
9. Получите последовательность МРТ.
   1. Выполните первичную локализацию и общую корректировку.
   2. Используйте средний сагиттальный срез и выровняйте^8-й срез от переднего с декузсацией передней спайки.
      Примечание: Корональные срезы расположены перпендикулярно горизонтальной плоскости, определяемой линией, соединяющей переднюю спайку и основание мозжечка, что соответствует углу приблизительно 15° относительно длинной оси мозолистого тела. Ключевыми параметрами сканирования T2-RARE для среднего сагиттального среза являются: время повторения (TR) = 2500 мс, время эхо-сигнала (TE) = 44 мс, поле зрения (FOV) = 3,5 см, размер матрицы = 256 256, толщина среза = 1 мм, количество срезов = 1, коэффициент RARE = 8, полоса пропускания = 75 кГц, количество средних значений = 1, время регистрации = 1 мин 20 с.
   3. Используйте быстрое получение с усилением релаксации (RARE) с подавлением жира и полосой насыщения под мозгом для получения Т2-взвешенных изображений для анатомического эталона (рис. 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основные параметры сканирования T2-RARE следующие: время повторения (TR) = 3600 мс, время эхо-сигнала (TE) = 40 мс, поле зрения (FOV) = 2 см, размер матрицы = 256 256, толщина среза = 1 мм, количество срезов = 16, фактор RARE = 8, полоса пропускания = 75 кГц, количество средних значений = 8, время регистрации = 7 мин 40 с.
   4. Используйте 4-зарядный спин-эхо EPI для получения изображений тензора диффузии (рис. 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основные параметры сканирования DTI: TR = 3000 мс, TE = 28 мс, поле зрения (FOV) = 2 см, размер матрицы = 96 96, толщина = 1 мм, количество срезов = 16, продолжительность импульса (δ) = 5 мс, время между двумя импульсами (Δ) = 15 мс, количество B0 = 5, количество направлений = 30, b-значение = 1000 с/мм³, ширина полосы = 150 кГц, число средних = 4, время сбора = 14 мин.
   5. Завершите протокол сканирования. Выдвиньте люльку животного из магнита. Извлеките животное из колыбели.
   6. Пересадите крысу в чистую клетку с грелкой под ней, чтобы поддерживать температуру ее тела. Верните крысу в ее домашнюю клетку, как только она придет в себя.
10. Предварительная обработка изображений
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте MRtrix3, программное обеспечение для статистического параметрического картографирования (SPM) и пользовательские скрипты MATLAB для обработки и анализа данных.
    1. Устраните шумоподавление изображений DTI с помощью команды MRtrix3 (dwidenoise)³⁰.
    2. Удалите артефакты звонка Гибба с изображений DTI с помощью команды MRtrix (mrdegibbs)³⁰.
    3. Совмещайте регистрацию изображений DTI с T2-взвешенными изображениями одного объекта на продольном сканировании с помощью функций SPM (spm_coreg.m и spm_powell.m).
    4. Выполните удаление черепа на Т2-взвешенных изображениях, вручную контурируя область мозга срез за срезом, с последующим удалением пикселей с интенсивностью ниже вычисленного порога, определенного методом³¹ Оцу (пользовательский скрипт MATLAB thr_otsu2.m).
    5. Провести межсубъектную корегистрацию среди животных одной экспериментальной группы с использованием функций SPM (spm_coreg.m и spm_powell.m). Наложите маску мозга на соответствующие изображения DTI.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Снятие черепа выполняется для сокращения времени компьютерной обработки.
    6. Расчет тензорных карт на основе DTI (пользовательский скрипт MATLAB, tensormap.m).
    7. Расчет карт FA (пользовательский скрипт MATLAB, calFA.m)
       ПРИМЕЧАНИЕ: Все пользовательские скрипты MATLAB доступны через следующую базу данных (https://doi.org/10.57770/9ZESXD).
11. Анализ изображений-FA
    1. Нарисуйте области интереса (ROI) в коре головного мозга и мозолистом теле (CC) для трех последовательных срезов изображения под координатой CHI.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Все показатели ROI были нарисованы вручную и визуально проверены на предмет грубых ошибок двумя опытными исследователями, не обращающими внимания на экспериментальные группы.
    2. Извлекайте и усредняйте значение FA из ROI.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для мозолистого тела под корой головного мозга пиксели со значениями FA < 0,35 были исключены из выбранного ROI для устранения эффектов частичного объема. Для коры головного мозга были набраны все пиксели со значениями FA < 0,35 в ROI.
12. Анализ изображений-Volume
    1. Вручную нарисуйте ROI, охватывающие области коры головного мозга, для 11 последовательных срезов изображения при Брегме от -7 до +3 мм.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Все ROI были нарисованы вручную 2 опытными исследователями, ослепленными экспериментальными группами.
    2. Суммируйте общее количество пикселей ROI по срезам и преобразуйте их в объем, умножив толщину среза (1 мм).
    3. Нормализуйте объем коры головного мозга после ЧС с соответствующим объемом перед ЧС каждого животного.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализуйте данные, чтобы устранить индивидуальные различия в объеме мозга у разных животных перед презентацией.

3. Оценка поведения

ПРИМЕЧАНИЕ: Поведенческие эксперименты проводятся с использованием теста на равновесие при ходьбе по лучу и мНСС до ОМС, а также через 1 и 50 дней после ЧСИ (Рисунок 1). Вся оценка проводилась как минимум двумя наблюдателями, чтобы обеспечить точность, непротиворечивость и объективность собранных данных.

1. Тест на балансировку при ходьбе по лучу
   1. Включите видеокамеру и запустите таймер.
   2. Поместите крыс на одном конце бревна (3 см в глубину, 3 см в ширину, 80 см в длину и 60 см над полом).
   3. Остановите таймер, как только крыса совершит один круговой рейс, упадет или застынет в течение 3 минут.
      1. Во время эксперимента наблюдайте за состоянием животного для оценки с помощью mNSS 11,32,33,34. Следуйте следующим стандартам для оценки:
      2. Если крыса сохраняет равновесие при устойчивой позе на бревне, присвойте балл 0.
      3. Если крыса ухватилась за сторону луча, назначьте 1 балл.
      4. Если крыса упала с одной конечностью от бревна, назначьте 2 балла.
      5. Если крыса падает с оторванными двумя конечностями или вращается на бревне (>60 с), присвойте балл 3.
      6. Если крыса пытается балансировать на бревне, но падает (>40 с), присвойте балл 4.
      7. Если крыса пытается балансировать на бревне, но падает (>20 с), присвойте балл 5.
      8. Если крыса не пытается балансировать или висеть на бревне и падает в течение 20 с, присвойте балл 6.
      9. Если крыса не справляется с заданием, считайте, что она потратила максимум 3 минуты, и присвойте ему 6 баллов.
   4. Планируйте дни тестирования в определенные моменты времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исключите крыс, не завершивших круговой ход по лучу в течение двух попыток до ЧС, из последующей операции и последующей поведенческой оценки.
2. Модифицированная шкала неврологической тяжести (mNSS)
   ПРИМЕЧАНИЕ: оценка mNSS включает в себя двигательные тесты, сенсорные тесты, отсутствие рефлекса, аномальные движения, равновесие луча и ходьбу по полу ^32,33, которые быстро выполнялись ежедневно.
   1. Проведите моторные тесты.
      1. Поднимите крысу за основание хвоста и наблюдайте за рефлексами ее конечностей в течение примерно 15 с, чтобы оценить правильное сгибание и разгибание.
      2. Если в передней конечности наблюдается нормальное сгибание, присвойте оценку 0. Если сгибания не наблюдается, присвойте балл 1.
      3. Если в задней конечности наблюдается нормальное сгибание, присвойте балл 0. Если сгибания не наблюдается, присвойте балл 1.
      4. Если голова перемещается на >10° к вертикальной оси в течение 30 с после поднятия крысы за хвост, присвойте оценку 0. Если нет, присвойте балл 1.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В этом сеансе теста будет присвоено максимум 3 балла.
   2. Проведите тесты по постановке конечностей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тест на размещение проводится для оценки координации между сенсорной (зрительной, тактильной чувствительностью и проприоцепцией) и моторной функцией.
      1. Медленно опустите крысу к поверхности стола. Понаблюдайте, дотянулись ли лапы крыс и вытянулись ли они к поверхности.
      2. Если крысы вышли на поверхность с обеими конечностями и вперед, присвойте балл 0. Если есть задержка или нет ответа, присвойте балл 1.
      3. Положите крысу на поверхность и притяните лапу к краю стола. Понаблюдайте, возвращается ли его лапа в нормальное положение на поверхности стола.
      4. Если наблюдаются немедленные и нормальные реакции на размещение, присвойте балл 0. Если наблюдаются ответы с задержкой размещения, присвойте балл 1. Если ответа нет, присвойте балл 2.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В этом сеансе теста будет присвоено максимум 3 балла.
   3. Наблюдайте за отражением отсутствия и ненормальных движений.
      1. Наблюдайте за покачиванием головой, чтобы оценить рефлекс ушной раковины при прикосновении к слуховому проходу ватным концом ватного тампона.
      2. Если наблюдается нормальный рефлекс, присвойте балл 0. Если рефлекса не наблюдается, присвойте балл 1.
      3. Оцените наличие роговичного рефлекса, прикоснувшись к роговице ватным концом ватного тампона.
      4. Если получен нормальный ответ, присвойте балл 0. Если реакция на моргание глазом не возникает, присвойте балл 1.
      5. Сделайте короткий и сильный хлопок в ладоши. Наблюдайте за наличием рефлекса испуга.
      6. Если наблюдается рефлекс, присвойте балл 0. Если рефлекса не наблюдается, присвойте балл 1.
      7. Понаблюдайте, есть ли у крысы судороги, миоклонус или миодистония.
      8. Если какой-либо из них возникает, присвойте балл 1.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В этом сеансе теста будет присвоено максимум 4 балла.
   4. Проведите проверку балансировки луча, как описано ранее (шаг 3.1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом сеансе теста будет присвоено не более 6 баллов.
   5. Проведите тест на ходьбу по полу.
      1. Подготовьте арену для открытого поля (длина 75 см, ширина 50 см и глубина 40 см). Убедитесь, что он чистый и не имеет каких-либо предыдущих признаков запаха.
      2. Поместите крысу в центр арены открытого поля и наблюдайте, как крыса ходит по арене.
      3. Если крыса выполняет обычную прогулку, присвойте балл 0.
      4. Если крыса не может ходить прямо, присвойте ей 1 балл.
      5. Если крыса падает на паретическую сторону после того, как положила ее на пол, назначьте 3 балла.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В этом сеансе теста будет присвоено максимум 3 балла.
   6. Суммируйте все баллы; Максимально возможный балл – 18.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокий балл указывает на худший исход.

4. Иммуногистология

1. Выполнение транскардиальной перфузии³⁵.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Транскардиальная перфузия проводится после МРТ через 50 дней после ЧСН (Рисунок 1).
   1. Поместите крысу в небольшую индукционную камеру и обезболите ее изофлураном (5%) до тех пор, пока она не перестанет реагировать на щипание лапы или хвоста.
   2. Введите 50 мг/кг массы тела золетила (50 мг/мл) и 10 мг/кг массы тела ксилазина (Румпун, 23,32 мг/мл) через внутрибрюшинную инъекцию для глубокой анестезии.
   3. Поместите крысу в положение лежа на спине.
   4. Сделайте поперечный разрез примерно 4-5 см в длину под грудной клеткой с помощью ножниц.
   5. Найдите диафрагму и разрежьте ее, чтобы обнажить сердце.
   6. С помощью кровоостанавливающих щипцов пережимают легочную артерию, а затем делают разрез примерно 0,5-1 см в длину в правом предсердии.
   7. Подсоедините иглу к трубопроводу, прикрепленному к инфузионному насосу.
   8. Введите иглу в левый желудочек.
   9. Промойте животное с помощью транскардиальной перфузии (40 мл/мин) 500 мл 0,9% физиологического раствора до тех пор, пока кровь не станет прозрачной.
   10. Перфузируют животное через транскардиальную перфузию (40 мл/мин) 500 мл 4% параформальдегида (PFA) для фиксации.
   11. Удалите голову крысы и осторожно снимите мозговую ткань с черепа.
   12. Сохраняйте мозг в концентрации примерно 20 мл 4% PFA во флаконе в течение 48 часов для постфиксации.
2. Выполнение обработки тканей и окрашивание ИГХ^36,37.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните иммуногистохимическое окрашивание фиксированных формалином и залитых парафином срезов тканей с использованием набора системы вторичного обнаружения иммунопероксидазы.
   1. Используйте фиксированные формалином и залитые парафином срезы ткани.
   2. Проведите депарафинизацию и обработайте предметные стекла 3%_H2O2 для блокирования активности эндогенной пероксидазы. Выполните забор антигена с помощью цитратного буфера при 90 °C.
   3. Проводят иммуногистохимическое окрашивание с помощью набора системы вторичного обнаружения иммунопероксидазы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры окрашивания проводятся в соответствии с рекомендациями производителя.
   4. Используйте гематоксилин для противодействия окрашиванию образцов.
   5. Установите образцы с помощью реагента, препятствующего выцветанию.
   6. Используйте антитела к антиглиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) для иммуногистохимического окрашивания.
   7. Получение изображений ROI с помощью сканера предметных стекол под световым микроскопом (рис. 6).

5. Статистический анализ поведения и имиджевых результатов

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании был проведен статистический анализ в SPSS; Тем не менее, статистический анализ может быть выполнен и в других статистических инструментах.

1. Загрузите данные в широком формате в файл SPSS *.sav.
2. Проведите анализ дисперсии повторных измерений (ANOVA) для сравнения поведенческих (нормализованный вес, mNSS и продолжительность прогулки по лучу) и визуальных результатов (значения FA в коре головного мозга и CC) с течением времени среди групп.
   1. Нажмите кнопку Анализ > общей линейной модели > повторяющихся измерений.
   2. Назначьте имя в поле «Имя фактора внутри темы» (например, время) и поставьте «3» в поле «Количество уровней» (три уровня с разными временными точками последующего выполнения). Назначьте имя в поле Имя меры (например, mNSS) в диалоговом окне Повторяющиеся меры определяют факторы.
   3. Загрузите внутрисубъектные переменные (данные, полученные до, D1 и D50 после CHI), которые необходимо проверить, и укажите межсубъектный фактор (например, группы животных с различными параметрами воздействия) в диалоговом окне «Повторяющиеся измерения».
   4. Выберите метод Бонферрони в качестве апостериорного теста для фактора (например , групп животных) в диалоговом окне апостериорных множественных сравнений для наблюдаемых средних .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы скорректировать множественные сравнения, ошибка I типа была скорректирована с помощью поправок Бонферрони (0,05/3) для сравнений с течением времени. Статистическая значимость была определена как p < 0,05 (с поправкой на SPSS).
3. Проведите односторонний анализ ANOVA для сравнения рефлекса выпрямления и изменения объема коры головного мозга в группах.
   1. Нажмите кнопку Анализ > Сравнить средние значения > односторонней ANOVA.
   2. Загрузите переменные (рефлекс коррекции и изменение объема коры головного мозга) в список зависимых и группы в качестве фактора в диалоговом окне One-Way ANOVA .
   3. Выберите метод Бонферрони в качестве апостериорного теста в диалоговом окне One-Way ANOVA: Post Hoc Multiple Comparisons .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для коррекции множественных сравнений ошибка I типа была скорректирована с помощью поправки Бонферрони (0,05/5) для сравнений между группами. Статистическая значимость была определена как p < 0,05 (с поправкой на SPSS).

На рисунке 2 представлены продольные МРТ репрезентативного животного с симуляцией и повторяющейся ХСН в SMCx. На Т2-взвешенных изображениях через 1 и 50 дней после ЧИ не было обнаружено значительного перелома черепа или ушиба головного мозга. На картах ФА ...

Это исследование было направлено на создание животной модели неосложненной легкой черепно-мозговой травмы (ЧМТ) для оценки кумулятивных эффектов одиночных и повторяющихся травм, а также результатов воздействий на различные области мозга. Модель закрытой черепно-мо?...

У авторов нет потенциальных конфликтов интересов, которые можно было бы раскрыть.

Эта работа была поддержана исследовательским грантом от Национального совета по науке и технике (NSTC) Тайваня (NSTC 113-2314-B-A49-047).